mikrobioloģijā: mikroskopa projektēšana un dzīvo mikroorganismu mikroskopijas pamatmetodes

1 Dažādu veidu mikroskopijas iezīmes

2 Spilgtā lauka mikroskopa ierīce

3 Noteikumi darbam ar iegremdējamo objektīvu

4 Dzīvu mikroorganismu mikroskopijas metodes

1 Dažādu veidu mikroskopijas iezīmes

Galvenie mikroskopijas uzdevumi ir šādi:

Mikroorganismu identificēšana dažādos materiālos.

Provizoriska mikroorganismu identifikācija paraugā.

Dažu pārbaude morfoloģiskās pazīmes un mikroorganismu struktūras (piemēram, kapsulas, flagellas utt.).

Koloniju un tīrkultūru krāsotu uztriepes izpēte.

Gaismas mikroskopija mūsdienās ir visplašāk izmantotā.

Gaismas mikroskopija nodrošina palielinājumu līdz 2–3 tūkstošiem reižu, dzīva objekta krāsainu un kustīgu attēlu, mikrokino un tā paša objekta ilgtermiņa novērošanas iespēju, tā dinamikas un ķīmijas novērtējumu. Attēls gaismas mikroskopā veidojas sakarā ar to, ka objekts un tā dažādās struktūras selektīvi absorbē gaismu ar dažādu viļņu garumu (absorbcijas kontrasts) vai gaismas viļņa fāzes maiņas dēļ, kad gaisma iet caur objektu (fāzes kontrasts). ).

Jebkura mikroskopa galvenās īpašības ir izšķirtspēja un kontrasts. Izšķirtspēja Ir minimālais attālums, kurā mikroskops parāda divus punktus atsevišķi. Labākai redzei cilvēka acs izšķirtspēja ir 0,2 mm. Attēla kontrasts- šī ir atšķirība starp attēla spilgtumu un fonu. Ja šī atšķirība ir mazāka par 3-4%, tad to nevar iemūžināt ne ar aci, ne ar fotoplati; tad attēls paliks neredzams, pat ja mikroskops atrisinās tā detaļas. Kontrastu ietekmē gan objekta īpašības, kas maina gaismas plūsmu salīdzinājumā ar fonu, gan optikas spēja noķert no tā izrietošās stara īpašību atšķirības. Gaismas mikroskopa iespējas ierobežo gaismas viļņu raksturs. Gaismas fizikālās īpašības - krāsa (viļņa garums), spilgtums (viļņu amplitūda), fāze, blīvums un viļņu izplatīšanās virziens mainās atkarībā no objekta īpašībām. Šīs atšķirības tiek izmantotas mūsdienu mikroskopos, lai radītu kontrastu.

Mikroskopa palielinājums ir definēts kā objektīva palielinājuma reizinājums ar okulāra palielinājumu. Tipiskiem pētnieciskajiem mikroskopiem okulāra palielinājums ir 10, bet objektīva palielinājums ir 10, 40 un 100. Attiecīgi šāda mikroskopa palielinājums svārstās no 100 līdz 1000. Dažiem mikroskopiem ir palielinājums līdz 2000. Pat lielākam palielinājumam nav jēga, jo izšķirtspēja neuzlabojas. Gluži pretēji, attēla kvalitāte pasliktinās.

Skaitliskā diafragma izmanto, lai izteiktu optiskās sistēmas izšķirtspēju. Skaitliskā apertūra ir objektīva optiskais "pārklājums" un mēra gaismas daudzumu, kas nonāk objektīvā. Objektīva skaitliskā apertūra ir norādīta uz cilindra. Kondensatora apertūrai ir jāatbilst objektīva skaitliskajai apertūrai. Jebkura objektīva, kas atrodas blakus gaisam (ti, "sausā sistēma") skaitliskā apertūra nevar pārsniegt 1, jo gaisa laušanas koeficients ir 1. Skaitlisko apertūru var palielināt, palielinot gaismas laušanas koeficientu videi starp frontālo objektīvu un objektīvu. priekšmetstikliņu.tuvinot to stikla laušanas koeficientam (1.5). Šim nolūkam šķidruma piliens, kura laušanas koeficients ir lielāks par gaisa laušanas koeficientu, piemēram, ūdens piliens (n ​​= 1,3), glicerīns (n ​​= 1,4) vai ciedra (imersijas) eļļa (n = 1,5). Katram no iepriekšminētajiem šķidrumiem tiek ražotas īpašas lēcas, kuras sauc par iegremdēšanas lēcām.

Gaismas mikroskopija ietver parasto pārraides mikroskopija (gaišais, tumšais lauks), fāzes kontrasts, luminiscējoša. Nesen ir izstrādātas citas mikroskopijas un mikroskopu metodes - inversija un konfokālā lāzera skenēšanas mikroskopija.

Brightfield mikroskopija ļauj izpētīt objektus caurlaidīgā gaismā spilgtā laukā. Šis mikroskopijas veids ir paredzēts, lai pētītu šūnu morfoloģiju, izmēru, to relatīvo stāvokli, šūnu strukturālo organizāciju un citas pazīmes. Gaismas mikroskopa maksimālā izšķirtspēja ir 0,2 mikroni, kas nodrošina augstas precizitātes mikroskopa palielinājumu līdz 1500x.

Fāzes kontrasta mikroskopija ļauj skaidrāk novērot dzīvos caurspīdīgus objektus, kuru laušanas koeficienti ir tuvu vides refrakcijas rādītājiem. Fāzes kontrasta mikroskopa darbības pamatā ir gaismas traucējumi attēla plaknē fāzes nobīdes dēļ (ja diafragmas diafragmā tiek izmantots fāzes gredzens). Fāzu kontrasta mikroskopijā bieži izmanto bioloģiskos mikroskopus ar reverso optiku - apgrieztos mikroskopus. Šiem mikroskopiem ir lēcas apakšā un kondensators augšpusē.

Fāzu kontrasta mikroskopija tiek izmantota, lai pētītu šūnu formu, izmēru, relatīvo stāvokli, to mobilitāti, vairošanos, mikroorganismu sporu dīgšanu utt. Pateicoties šīs mikroskopijas metodes izmantošanai, dzīvu nekrāsotu mikroorganismu kontrasts strauji palielinās un tie izskatās tumšs uz gaiša fona (pozitīvs fāzes kontrasts) vai gaišs uz tumša fona (negatīvs fāzes kontrasts).

Tumšā lauka mikroskopija pamatojoties uz objekta apgaismojumu ar slīpiem gaismas stariem. Šāda veida gaisma neskar objektīvu, tāpēc redzes lauks izskatās tumšs. Šāds preparāta apgaismojums tiek panākts, izmantojot īpašu tumšā lauka kondensatoru. Tumšā lauka mikroskopija ir ļoti vienkārša, bet efektīva metode, un tā ir labi piemērota dzīvu un nekrāsotu bioloģisko paraugu attēlveidošanai. Ņemot vērā uzstādīšanas vienkāršību, iegūto attēlu kvalitāte ir diezgan laba.

Mikroskopējot tumšā laukā, var redzēt objektus, kuru lielums tiek mērīts mikrometra simtdaļās, kas pārsniedz parastā spilgtā lauka mikroskopa izšķirtspēju. Taču objektu novērošana tumšā laukā ļauj pētīt tikai šūnu aprises un nedod iespēju izpētīt to iekšējo uzbūvi.

Luminiscences (fluorescences) mikroskopija pamatojoties uz vairāku bioloģiskas izcelsmes vielu vai dažu krāsvielu spēju mirdzēt, ja tās tiek apgaismotas ar neredzamu ultravioleto vai zilo gaismu. Izmantojot ultravioleto gaismu, mikroskopa izšķirtspēja var sasniegt 0,1 mikronu.

Mikroorganismu šūnas tiek apstrādātas ar īpašām krāsvielām - fluorhromiem (akridīna oranžs, primulīns, rodamīns uc) ļoti atšķaidītu ūdens šķīdumu veidā: 1: 500–1: 100 000. Šādi šķīdumi ir nedaudz toksiski, kas ļauj pētīt neskarta šūna. Atkarībā no ķīmiskā sastāva šūnu struktūras dažādās pakāpēs absorbē krāsvielas un dažādos veidos luminiscē. Turklāt dzīvās un atmirušās šūnas fluorohromus neabsorbē vienādi. Tas ļauj izmantot dotais skats mikroskopija citoloģiskiem un imunoloģiskiem pētījumiem, šūnu dzīvotspējas noteikšanai u.c.

Elektronu mikroskopija ļauj noteikt objektus, kas nav atrisināti, izmantojot gaismu vai ultravioletos starus. Teorētiski atļauja transmisijas elektronu mikroskops ir 0,002 nm; reāla mūsdienu izšķirtspēja elektronu mikroskopi tuvojas 0,1 nm. Praksē bioloģisko objektu izšķirtspēja sasniedz 2 nm.

Īsais elektronu viļņa garums ļauj atšķirt objektus ar izmēru 0,5–1,0 nm. Mūsdienu elektronu mikroskopos uz ekrāna tiek panākts palielinājums 5000-200000. Pateicoties tik augstajai izšķirtspējai, kļūst iespējams atklāt baktēriju struktūru detaļas. Piemēram, izsmidzinot smago metālu sāļus, kas ieskauj baktēriju un iekļūst virsmas nelīdzenumos, tiek iegūts kontrasts elektronu diferenciālās aizkaves dēļ. Šo efektu sauc negatīvs kontrasts .

Par elektronu mikroskopu, kurā attēls veidojas, elektroniem izejot (pārraides) caur paraugu, sauc. caurspīdīgs (vai transmisija ).

V skenējošais elektronu mikroskops (skenējošā elektronu mikroskopija (SEM)) elektronu stars ātri skenē parauga virsmu, izraisot starojumu, veidojot attēlu uz gaismas ekrāna. SEM raksturo augsta izšķirtspēja, plašs palielinājumu diapazons (līdz 100 000 un vairāk), liels fokusēšanas dziļums (~ 100 µm) un dažādi darbības režīmi. Skenējošais mikroskops nodrošina virsmu attēlu un ļauj iegūt trīsdimensiju attēlu.

Lāzera konfokālā mikroskopija ļauj iegūt skaidru attēlu un novērot objektus fokusā visā laukā. Šī metode ir piemērota tikai pašgaismojošu (fluorescējošu) objektu izpētei. Apvienojot ar datortehnoloģiju, iespējama pētāmā objekta telpiskā rekonstrukcija. Konfokālajā lāzerskenējošā mikroskopā iekšējo sekciju attēlus veido skenējot ar fokusētu lāzera staru no dažādiem (405, 488, 532, 635 nm) lāzeriem un starojuma telpisko filtrāciju. Izmantojot tuvā lauka skenēšanas mikroskopiju (SMBP), tiek sasniegta augsta izšķirtspēja. Mazākais elementa izmērs, kas iegūts ar SMPS, ir 20 nm pie gaismas viļņa garuma 0, 486 nm. Kontrolējamā elementa attēlā nav difrakcijas vai traucējumu efektu, kas apgrūtina tā robežu noteikšanu. SMBP atšķirīga iezīme salīdzinājumā ar atomu spēka mikroskopu ir tā jutība pret kontrolētā parauga virsmas optiskajiem raksturlielumiem, gaismas viļņa garumu, luminiscenci utt.

Datora traucējumu mikroskopija ļauj iegūt augsta kontrasta attēlu, novērojot subcelulāras struktūras; daudzos gadījumos to izmanto dzīvo šūnu pētīšanai. Automātiskā interferences mikroskopa darbības princips ir balstīts uz lāzera starojuma gaismas staru staru traucējumiem, kas atstarojas no atskaites spoguļa un spoguļa, uz kura tiek novietots izmērītās fāzes objekts. Teorētiski maksimālā sasniedzamā izšķirtspēja var būt vidēji 0,2 nm, praksē tā ir 0,4 μm.

Rentgena datortomogrāfija (RCT), pozitronu emisijas tomogrāfija (PAT) ļauj novērot objektus normālos apstākļos.

Histoloģiskā tehnika. Mikroskopijas metodes un tehnikas

Nodarbības mērķis: Iepazīties ar speciālo mikroskopijas iekārtu darbības principiem un izmantošanu pētniecības nolūkos. Nostiprināt histoloģiskā parauga mikroskopiskās izmeklēšanas prasmi.

vingrinājums:

1. Aizpildiet 2. tabulu, atzīmējot galvenos mikroskopijas veidus, to veidus, īsi norādiet katra veida izmantošanas mērķi.

2. tabula

Mikroskopijas metodes un tehnikas

1. Gaismas mikroskopija. Tiek izmantoti parastie gaismas mikroskopi un to varianti, kuros tiek izmantoti gaismas avoti ar dažādu viļņu garumu. Gaismas mikroskopā var redzēt ne tikai atsevišķas šūnas, kuru izmērs ir no 4 līdz 150 mikroniem, bet arī to intracelulārās struktūras - organellas un ieslēgumus. Lai uzlabotu mikroobjektu kontrastu, tiek izmantota to krāsošana.

a) Ultravioletā mikroskopija. Tiek izmantoti īsāki ultravioletie stari ar viļņa garumu aptuveni 0,2 mikroni. Iegūtais acij neredzams attēls tiek pārveidots par redzamu, reģistrējot to uz fotoplates vai izmantojot īpašas ierīces (luminiscējošu ekrānu, elektrooptisko pārveidotāju).

b) Fluorescences (luminiscences) mikroskopija. Metodes būtība ir tāda, ka vairāku vielu atomi un molekulas, absorbējot īsviļņu starus, nonāk ierosinātā stāvoklī. Apgrieztā pāreja no ierosinātā stāvokļa uz normālu notiek ar gaismas emisiju, bet ar garāku viļņa garumu. Tiek izmantotas īpaši augsta spiediena dzīvsudraba un ksenona spuldzes, kurām ir augsts spilgtums tuvu ultravioleto un zili violeto staru zonā. Jebkurai dzīva organisma šūnai ir sava fluorescence (bieži vien diezgan vāja).

Atšķirt:

Primārā fluorescence - serotonīns, kateholamīni (adrenalīns un norepinefrīns), kas atrodas nervu, masta un citās šūnās, pēc audu fiksācijas formaldehīda tvaikos (Falka metode).

Sekundārā fluorescence rodas, ja zāles apstrādā ar īpašām krāsvielām - fluorohromi.

c) Fāzes kontrasta mikroskopija.Šo metodi izmanto, lai iegūtu kontrasta attēlus no caurspīdīgiem un bezkrāsainiem dzīvo objektiem, kas nav redzami ar parastajām mikroskopijas metodēm. Šim nolūkam nekrāsotas konstrukcijas ievieto gredzenveida diafragmā, kas ievietota kondensatorā, un fāzes plāksnē objektīvā. Šāds optikas dizains dod iespēju caur nekrāsoto preparātu raidītās gaismas fāzes izmaiņas, kuras acs neuztver, pārveidot tās amplitūdas izmaiņās, t.i. iegūtā attēla spilgtums.

d) Mikroskopija tumšā laukā. Mērķi sasniedz tikai gaisma, kas nodrošina konstrukciju difrakciju preparātā. Mikroskopam ir īpašs kondensators, kas apgaismo paraugu ar stingri slīpu gaismu. Tādējādi lauks izskatās tumšs un smalkas daļiņas preparātā tiek atstarota gaisma, kas pēc tam nonāk objektīvā. Šo metodi izmanto, lai pētītu dzīvos objektus, piemēram, sudraba graudus, kas tumšā laukā šķiet gaiši. Klīnikā to izmanto, lai pētītu kristālus urīnā ( urīnskābe, oksalāti), lai demonstrētu spirohetas u.c.

e) Interferences mikroskopija. Tiek izmantots diferenciālo traucējumu mikroskops (ar Nomarski optiku), ko izmanto šūnu un citu bioloģisko objektu virsmas reljefa pētīšanai.

Šajā mikroskopā gaismas stars no apgaismotāja ir sadalīts divās plūsmās: viena iet caur objektu un maina svārstību fāzi, otra iet, apejot objektu. Objektīvajās prizmās abi stari ir savienoti un traucē viens otru. Rezultātā tiek uzbūvēts attēls, kurā mikroobjekta sekcijas dažāds biezums un blīvumi atšķiras pēc kontrasta pakāpes. Pēc izmaiņu kvantitatīvās noteikšanas nosaka koncentrāciju un sausnas masu.

Šīs mikroskopijas priekšrocība ir iespēja novērot šūnas kustības un mitozes laikā. Šajā gadījumā šūnu kustības reģistrāciju var veikt, izmantojot time-lapse mikrokino.

f) Tumšā lauka mikroskops To izmanto, lai iegūtu caurspīdīgu dzīvo objektu attēlus. Paraugs tajā tiek skatīts tādā "slīpā" apgaismojumā, ka tieša gaisma nevar iekļūt objektīvā. Attēlu veido no objekta izkliedētā gaisma, un rezultātā objekts uz tumša fona šķiet ļoti gaišs (ar ļoti augstu kontrastu).

2. Polarizējošā mikroskopija. Polarizējošais mikroskops ir gaismas mikroskopa modifikācija, kurā ir uzstādīti divi polarizējošie filtri - pirmais (polarizators) starp gaismas staru un objektīvu un otrais (analizators) starp objektīvu un aci. Abus filtrus var pagriezt, lai mainītu gaismas stara virzienu. Struktūras, kas satur gareniski orientētas molekulas (kolagēns, mikrotubulas, mikrofilamenti) un kristāla struktūras (Leidigā sēklinieku glandulocīti), parādās kā gaišas, mainoties rotācijas asij. Kristālu vai parakristālisku veidojumu spēju sadalīt gaismas vilni parastā un tam perpendikulāri sauc par divreizējo laušanu. Šī spēja piemīt šķērssvītrotu muskuļu fibrilām.

3. Elektronu mikroskopija. Aplūkojot gaismas mikroskopa raksturlielumus, var redzēt, ka vienīgais veids, kā palielināt optiskās sistēmas izšķirtspēju, ir izmantot apgaismojuma avotu, kas izstaro viļņus ar mazāko viļņa garumu. Šāds avots var būt sarkanīgi karsts pavediens, kas elektriskajā laukā izmet elektronu plūsmu, pēdējo var fokusēt, izlaižot to caur magnētisko lauku. Tas kalpoja par pamatu elektronu mikroskopa izveidei, kurā jau ir sasniegta 0,1 nm izšķirtspēja. Elektronu mikroskopa uzbūves princips ir ļoti līdzīgs optiskajam: tam ir apgaismojuma avots (elektronu lielgabala katods), kondensatora sistēma (kondensatora magnētiskā lēca), objektīvs (objektīva magnētiskā lēca), okulārs (projekcijas magnētiskais). lēcas), tikai tīklenes vietā elektroni nokrīt uz luminiscējošā ekrāna vai uz fotoplates. Elektronu mikroskopā tiek izmantota elektronu plūsma ar īsāku viļņu garumu nekā gaismas mikroskops. Izšķirtais attālums ir 100 000 reižu mazāks nekā gaismas mikroskopā. Mūsdienu elektronu mikroskopos izšķirtais attālums ir aptuveni 0,1–0,7 nm.

Šobrīd tiek izmantoti transmisijas un skenējošie elektronmikroskopi, kuriem ir liels lauka dziļums, plašs nepārtraukta palielinājuma diapazons (no 10 kV līdz 10 kV) un augsta izšķirtspēja.

2. Apsveriet gaismas mikroskopa uzbūvi. Atkārtojiet noteikumus darbam ar to.

Darbs ar mikroskopu... Tipiska bioloģiskā mikroskopa ierīce (1. att.). Statīva statīvs ir izgatavots kā smags lējums. Tam uz eņģes ir piestiprināts caurules turētājs, kurā ir visas pārējās mikroskopa daļas.

Izmantojot cauruli, kurā ir uzstādītas objektīvu sistēmas, varat tās pārvietot attiecībā pret paraugu fokusēšanai. Objektīvs atrodas caurules apakšējā galā.

Parasti mikroskops ir aprīkots ar vairākiem dažāda palielinājuma objektīviem uz rotējošās galvas, kas ļauj tos uzstādīt darba stāvoklī uz optiskās ass. Pārbaudot paraugu, operators parasti sāk ar objektīvu, kuram ir vismazākais palielinājums un visplašākais redzes lauks, atrod interesējošās detaļas un pēc tam pārbauda tās, izmantojot objektīvu ar lielāko palielinājumu.

Okulārs ir uzstādīts izvelkama turētāja galā, ar kuru vajadzības gadījumā var mainīt tūbiņas garumu. Virzoties augšup un lejup pa visu cauruli ar objektīvu un okulāru, mikroskops tiek fokusēts.

Par paraugu parasti ņem ļoti plānu caurspīdīgu slāni vai šķēli, novieto uz taisnstūrveida stikla plāksnes, ko sauc par stikla priekšmetstikliņu, un pārklāj ar plānāku, mazāku stikla plāksni, ko sauc par pārklājumu. Lai palielinātu kontrastu, paraugu bieži iekrāso ar ķīmiskām vielām.

Slaids tiek novietots uz skatuves tā, lai paraugs atrastos virs skatuves centrālās atveres. Skatuve, kā likums, ir aprīkota ar mehānismu vienmērīgai un precīzai parauga kustībai redzes laukā.

Trešā lēcu sistēma, kondensators, koncentrē gaismu uz paraugu. Kondensatora turētājs, kuru var būt vairāki, atrodas zem skatuves. Ir arī varavīksnenes diafragma diafragmas atvēruma regulēšanai. Zem tā ir kardānveida savienojuma apgaismojuma spogulis. Sakarā ar to, ka spogulis atstaro lampas gaismu uz parauga, mikroskopa optiskā sistēma rada redzamu attēlu.

Rīsi. 1. Mikroskops bioloģiskiem pētījumiem.

A-vispārējs skats: 1 - bāze; 2 - caurules turētājs; 3 - caurule; 4 - mikropadeves mehānisma kaste; 5 - rotējoša ierīce; 6 - priekšmetu tabula; 7 - makroskopiskā skrūve; 8 - mikrometriskā skrūve; 9 - kondensatora skrūve; 10 - okulārs; 11 - lēcas; 12 - kondensators ar varavīksnenes diafragmu; 13 - spogulis; B - maza (a), liela (b) un iegremdēšanas (c) palielinājuma lēcas.

3. Apsveriet slaidus (3. tabula), skice, zīme. Norādiet krāsvielas veidu un palielinājumu.

3. tabula

Audu preparāti ar dažādu krāsojumu

Galvenā bioloģisko mikroobjektu izpētes metode ir gaismas un elektronu mikroskopija, ko plaši izmanto eksperimentālajā un klīniskajā praksē.

Mikroskopija ir galvenā mikroobjektu izpētes metode, ko bioloģijā izmanto jau vairāk nekā 300 gadus. Histoloģisko preparātu pētīšanai izmanto dažāda veida gaismas mikroskopus un elektronu mikroskopus. Kopš pirmo mikroskopu radīšanas un izmantošanas tie ir pastāvīgi pilnveidoti. Mūsdienu mikroskopi ir sarežģīti optiskās sistēmas ar augstu izšķirtspēju. Mazākās struktūras izmēru, ko var redzēt ar mikroskopu, nosaka mazākais izšķirtspējas attālums (d), kas galvenokārt ir atkarīgs no gaismas viļņa garuma (λ) un elektronu plūsmas elektromagnētisko svārstību viļņa garuma utt. Šī atkarība ir aptuveni noteikts pēc formulas d= λ / 2. Tādējādi, jo īsāks ir viļņa garums, jo mazāks ir izšķirtais attālums un mazākas mikrostruktūras var redzēt preparātā.

Gaismas mikroskopija. Histoloģisko mikroobjektu pētīšanai izmanto parastos gaismas mikroskopus un to šķirnes, kuros izmanto gaismas avotus ar dažāda garuma viļņiem. Parastajos gaismas mikroskopos dabiskā vai mākslīgā gaisma kalpo kā apgaismojuma avots (2.1. att.). Spektra redzamās daļas minimālais viļņa garums ir aptuveni 0,4 µm. Tāpēc parastajam gaismas mikroskopam mazākais izšķiramais attālums ir aptuveni 0,2 µm, un kopējais palielinājums (objektīva palielinājuma reizinājums ar okulāra palielinājumu) var būt 1500–2500.

Tādējādi, izmantojot gaismas mikroskopu, var redzēt ne tikai atsevišķas šūnas, kuru izmērs ir no 4 līdz 150 mikroniem, bet arī to intracelulārās struktūras - organellas, ieslēgumus. Lai uzlabotu mikroobjektu kontrastu, tiek izmantota to krāsošana.

Ultravioletā mikroskopija.Šis ir gaismas mikroskopijas veids. Ultravioletais mikroskops izmanto īsākus ultravioletos starus, kuru viļņa garums ir aptuveni 0,2 μm. Izšķirtais attālums šeit ir 2 reizes mazāks nekā parastajos gaismas mikroskopos un ir aptuveni 0,1 μm. Ultravioletajos staros iegūts acij neredzams attēls tiek pārveidots par redzamu, reģistrējot to uz fotoplates vai izmantojot īpašas ierīces (luminiscējošais ekrāns, elektrooptiskais pārveidotājs).

Fluorescences (luminiscences) mikroskopija. Fluorescences fenomens sastāv no tā, ka vairāku vielu atomi un molekulas absorbē īsu

Rīsi. 2.1. Bioloģiskās izpētes mikroskopi:

a- gaismas bioloģiskais mikroskops "Biolam-S": 1 - bāze; 2 - tu-pērlīšu turētājs; 3 - slīpa caurule; 4 - okulārs; 5 - revolveris; 6 - lēcas; 7 - galds; 8 - kondensators ar varavīksnenes diafragmu; 9 - kondensatora skrūve; 10 - spogulis; 11 - mikrometriskā skrūve; 12 - makroskopiskā skrūve; b- elektronu mikroskops EMV-100AK ar automatizētu attēlu apstrādes sistēmu: 1 - mikroskopa kolonna (ar elektronu-optisko sistēmu un kameru paraugiem); 2 - vadības panelis; 3 - kamera ar luminiscējošu ekrānu; 4 - attēlu analīzes vienība; 5 - video signāla sensors; v- konfokālais mikroskops: 1 - gaismas mikroskops; 2 - attēla ierakstītājs (fotopavairotāja caurule);

3 - skenēšanas ierīce pārvietošanai gaismas stars pa asi X, Y, Z;

4 - barošanas bloks un lāzera vadības plaukts; 5 - dators attēlu apstrādei

viļņu stari, pāriet uz satrauktu stāvokli. Apgrieztā pāreja no ierosinātā stāvokļa uz normālu notiek ar gaismas emisiju, bet ar garāku viļņa garumu. Fluorescences mikroskopā kā gaismas avoti aizraujošai fluorescencei tiek izmantotas dzīvsudraba vai ksenona īpaši augsta spiediena spuldzes, kurām ir augsts spilgtums spektra apgabalā 0,25-0,4 mikroni (tuviem ultravioletajiem stariem) un 0,4-0,5 mikroni (zili-violetie stari). ). Fluorescences gaismas viļņa viļņa garums vienmēr ir lielāks par aizraujošās gaismas viļņa garumu, tāpēc tos atdala, izmantojot gaismas filtrus un objekta attēlu pēta tikai fluorescences gaismā. Atšķiriet savu vai primāro un inducēto vai sekundāro fluorescenci. Jebkurai dzīva organisma šūnai ir sava fluorescence, taču tā bieži ir ārkārtīgi vāja.

Serotonīnam, kateholamīniem (adrenalīns, norepinefrīns), kas atrodas nervu, masta un citās šūnās, pēc audu fiksācijas formaldehīda tvaikos 60-80 ° C temperatūrā (Falka metode) ir primārā fluorescence.

Sekundārā fluorescence rodas, ja preparātus apstrādā ar īpašām krāsvielām - fluorohromiem.

Ir dažādi fluorohromi, kas specifiski saistās ar noteiktām makromolekulām (akridīna apelsīns, rodamīns, fluoresceīns utt.). Piemēram, ja zāles apstrādā ar akridīna apelsīnu, DNS un tās savienojumi šūnās iegūst spilgti zaļu mirdzumu, savukārt RNS un tās atvasinājumi ir spilgti sarkanā krāsā. Ir daudz krāsvielu, ar kurām var identificēt olbaltumvielas, lipīdus, intracelulāros kalcija, magnija, nātrija jonus utt. Tādējādi starojuma spektrālais sastāvs satur informāciju par objekta iekšējo struktūru un tā struktūru. ķīmiskais sastāvs... Fluorescences mikroskopijas metodes variantu, kurā spektra ultravioletajā reģionā notiek gan ierosme, gan fluorescences emisija, sauc par ultravioletās fluorescences mikroskopijas metodi.

Lai palielinātu fluorohromētu objektu kontrastu, izmantojiet konfokālā iespēja optiskais mikroskops (skat. 2.1. att., c). Kā apgaismojums tiek izmantots neliela diametra monohromatisks gaismas stars, kas rada lāzera avots... Katrā laika brīdī mikroskopa fokusā atrodas neliels šūnas laukums (tilpums). Gaismas stars pārvietojas pa objektu (skenē objektu pa asīm X, Y, Z). Ar katru gaismas stara kustību pa vienu no skenēšanas līnijām tiek iegūta informācija par pētāmo struktūru, kas atrodas noteiktā punktā (tilpumā) gar skenēšanas līniju (šūnas optiskā sadaļa), piemēram, par proteīnu lokalizāciju. šūnas mikrotubulās. Visa informācija, kas saņemta no katra šūnas skenēšanas punkta, tiek pārsūtīta uz datoru, kombinējot, izmantojot īpaša programma un tiek parādīts monitora ekrānā kontrastējoša attēla veidā. Ar šīs mikroskopijas metodes palīdzību tiek iegūta informācija par šūnu formu, citoskeletu, kodola uzbūvi, hromosomām u.c.. Ar programmas palīdzību dators, pamatojoties uz informāciju, kas saņemta no katras skenēšanas līnijas, izveido šūnas tilpuma attēls, kas ļauj apskatīt šūnu no dažādiem skata leņķiem.

Fāzes kontrasta mikroskopija.Šo metodi izmanto, lai iegūtu kontrasta attēlus no caurspīdīgiem un bezkrāsainiem dzīvo objektiem, kas nav redzami ar parastajām mikroskopijas metodēm. Metodes pamatā ir fakts, ka gaisma, ejot cauri struktūrām ar dažādiem refrakcijas rādītājiem, maina savu ātrumu. Izmantotais mikroskopa optikas dizains ļauj ar aci neuztvertās caur nekrāsoto preparātu raidītās gaismas fāzu izmaiņas pārveidot tās amplitūdas, t.i., iegūtā attēla spilgtuma, izmaiņās. Fāzu kontrasta metode nodrošina pētīto neiekrāsoto struktūru kontrastu, pateicoties kondensatorā ievietotai speciālai gredzenveida diafragmai un objektīvā izvietotajai tā sauktajai fāzes plāksnei. Fāzes kontrasta metodes variants ir fāzes-tumšā lauka kontrasta metode, kas rada negatīvu attēlu salīdzinājumā ar pozitīvu fāzes kontrastu.

Tumšā lauka mikroskopija. Tumšā lauka mikroskopā mērķi sasniedz tikai gaisma, kas nodrošina paraugā esošo struktūru difrakciju (viļņu saliekšanu). Tas notiek, jo mikroskopā ir īpašs kondensators, kas apgaismo paraugu ar stingri slīpu gaismu; stari no apgaismotāja ir vērsti no sāniem. Tādējādi lauks izskatās tumšs, un mazās daļiņas preparātā atspoguļo gaismu, kas pēc tam nonāk objektīvā. Klīnikā šo metodi izmanto, lai pētītu kristālus urīnā (urīnskābi, oksalātus), lai demonstrētu spirohetas, jo īpaši Treponema pallidum, izraisot sifilisu utt.

Interferences mikroskopija. Fāzes kontrasta mikroskopa variants ir interferences mikroskops, kas paredzēts audu masas kvantitatīvai noteikšanai. Diferenciālo traucējumu mikroskops (ar Nomarski optiku) tiek izmantots, lai pētītu šūnu un citu bioloģisko objektu virsmas reljefu.

Interferences mikroskopā gaismas stars no apgaismotāja tiek sadalīts divās plūsmās: viena iet caur objektu un maina svārstību fāzi, otra iet apejot objektu. Objektīvās prizmās abi stari ir uzlikti viens otram. Rezultātā tiek konstruēts attēls, kurā dažāda biezuma un blīvuma mikroobjekta laukumi atšķiras pēc kontrasta pakāpes. Pēc izmaiņu kvantitatīvās noteikšanas nosaka koncentrāciju un sausnas masu.

Fāzu kontrasta un traucējumu mikroskopi ļauj pētīt dzīvās šūnas. Tie izmanto traucējumus, kas rodas, apvienojot divas viļņu kopas, lai izveidotu mikrostruktūru attēlu. Fāzes kontrasta, traucējumu un tumšā lauka mikroskopijas priekšrocība ir iespēja novērot šūnas kustības un mitozes procesā. Šajā gadījumā šūnu kustības reģistrāciju var veikt, izmantojot time-lapse (time-lapse) mikrovideo.

Polarizējošā mikroskopija. Polarizējošais mikroskops ir gaismas mikroskopa modifikācija, kurā ir uzstādīti divi polarizējošie filtri: pirmais (polarizators) atrodas starp gaismas staru un objektu, bet otrais (analizators) atrodas starp objektīvu un aci. Gaisma iet caur pirmo filtru tikai vienā virzienā, otrajam filtram ir galvenā ass,

kas atrodas perpendikulāri pirmajam filtram, un tas nepārlaiž gaismu. Rezultāts ir tumša lauka efekts. Struktūrām, kas satur garenvirzienā orientētas molekulas (kolagēnu, mikrotubulas, mikrofilamentus) un kristāla struktūras, piemīt īpašība griezt no polarizatora izplūstošo gaismas staru asi. Kad rotācijas ass tiek mainīta, šīs struktūras izskatās kā mirdzošas uz tumša fona. Kristālu vai parakristālisku veidojumu spēju sadalīt gaismas vilni parastā un tam perpendikulāri sauc par divreizējo laušanu. Šī spēja piemīt šķērssvītrotu muskuļu fibrilām.

Elektronu mikroskopija. Liels solis uz priekšu mikroskopijas tehnoloģijas attīstībā bija elektronu mikroskopa izveide un izmantošana (sk. 2.1. att.). Elektronu mikroskopā tiek izmantota elektronu plūsma ar īsāku viļņu garumu nekā gaismas mikroskops. Pie 50 000 V sprieguma elektromagnētisko svārstību viļņa garums, kas rodas no elektronu plūsmas kustības vakuumā, ir 0,0056 nm. Teorētiski ir aprēķināts, ka izšķirtais attālums šādos apstākļos var būt aptuveni 0,002 nm jeb 0,000002 mikroni, tas ir, 100 000 reižu mazāks nekā gaismas mikroskopā. Praktiski mūsdienu elektronu mikroskopos izšķirtais attālums ir aptuveni 0,1-0,7 nm.

Histoloģijā tiek izmantoti transmisijas (transmisijas) elektronu mikroskopi (TEM), skenējošie (rastra) elektronu mikroskopi (SEM) un to modifikācijas. Ar TEM palīdzību var iegūt tikai pētāmā mikroobjekta plakanu attēlu. SEM, kas spēj radīt trīsdimensiju attēlu, izmanto, lai iegūtu struktūru telpisku attēlojumu. Skenējošais elektronu mikroskops darbojas pēc pētāmā objekta skenēšanas principa ar elektronu mikrozondi, tas ir, secīgi “zondē” atsevišķus virsmas punktus ar asi fokusētu elektronu staru. Tādu objekta izpēti sauc skenēšana(lasot), un modelis, pa kuru pārvietojas mikrozonde, ir rastra. Iegūtais attēls tiek parādīts televizora ekrānā, kura elektronu stars pārvietojas sinhroni ar mikrozondi.

Skenējošās elektronu mikroskopijas galvenās priekšrocības ir liels lauka dziļums, plašs nepārtrauktas palielinājuma izmaiņu diapazons (no desmitiem līdz desmitiem tūkstošu reižu) un augsta izšķirtspēja. Mūsdienīgas iespējas instrumenti objekta virsmas pētīšanai ir atomu spēka mikroskops un skenējošais tuneļmikroskops.

Elektronu mikroskopija, izmantojot sasaldēšanas metodi- šķeldošana izmanto, lai izpētītu detaļas par membrānu struktūru un starpšūnu savienojumiem. Šķeldas ražošanai šūnas tiek sasaldētas zemā temperatūrā (-160 ° C). Pārbaudot membrānu, šķelšanās plakne iet caur lipīdu divslāņa vidu. Pēc tam metāli (platīns, pallādijs, urāns) tiek izsmidzināti uz iegūto membrānas pusīšu iekšējām virsmām, un tie tiek pētīti, izmantojot TEM un mikrogrāfus.

Krioelektronu mikroskopijas metode.Ātri sasaldētu plānu audu parauga slāni (apmēram 100 nm) novieto uz mikroskopiskā režģa un pārbauda mikroskopa vakuumā -160 ° C temperatūrā.

Elektronu mikroskopijas metode "Freeze-etch" izmanto šūnu membrānu ārējās virsmas pētīšanai. Pēc šūnu ātras sasaldēšanas ļoti zemā temperatūrā bloks tiek atdalīts ar naža asmeni. Iegūtos ledus kristālus atdala, sublimējot ūdeni vakuumā. Pēc tam šūnu apgabalus noēno, izsmidzinot plānu smago metālu (piemēram, platīna) kārtiņu. Metode ļauj atklāt konstrukciju trīsdimensiju organizāciju.

Tādējādi sasaldēšanas - šķeldošanas un sasaldēšanas - kodināšanas metodes ļauj pētīt nefiksētas šūnas, neveidojot tajās fiksācijas izraisītus artefaktus.

Smago metālu sāļu kontrastēšanas metodes ļauj elektronu mikroskopā izpētīt atsevišķas makromolekulas - DNS, lielus proteīnus (piemēram, miozīnu). Ar negatīvu kontrastu tiek pētīti makromolekulu (ribosomu, vīrusu) vai proteīna pavedienu (aktīna pavedieni) agregāti.

Krio-ultramikrotomijas rezultātā iegūto ultraplānu sekciju elektronu mikroskopija. Ar šo metodi audu gabaliņi bez fiksācijas un ieliešanas cietie medijiātri atdzesē šķidrā slāpeklī -196 ° C temperatūrā. Tas nodrošina šūnu vielmaiņas procesu kavēšanu un ūdens pāreju no šķidrās fāzes uz cieto. Pēc tam blokus zemā temperatūrā sagriež ultramikrotomā. Šo sekciju sagatavošanas metodi parasti izmanto, lai noteiktu fermentu aktivitāti, kā arī veiktu imūnķīmiskas reakcijas. Antigēnu noteikšanai tiek izmantotas antivielas, kas saistītas ar koloidālā zelta daļiņām, kuru lokalizāciju ir viegli noteikt uz preparātiem.

Ultraaugstsprieguma mikroskopijas metodes. Tiek izmantoti elektronu mikroskopi ar paātrinājuma spriegumu līdz 3 000 000 V. Šo mikroskopu priekšrocība ir tāda, ka tie ļauj pētīt liela biezuma objektus (1-10 mikroni), jo pie lielas elektronu enerģijas objekts tos mazāk absorbē. Stereoskopiskā attēlveidošana sniedz informāciju par intracelulāro struktūru trīsdimensiju organizāciju ar augstu izšķirtspēju (apmēram 0,5 nm).

Mikroskopiskās metodes pētījumiem

veidi, kā ar mikroskopu pētīt dažādus objektus. Bioloģijā un medicīnā šīs metodes ļauj izpētīt mikroskopisku objektu struktūru, kuru izmēri pārsniedz cilvēka acs izšķirtspēju. Pamats M.m un. veido vieglu un elektronisku. Praktiskajā un zinātniskās darbības dažādu specialitāšu ārsti - virusologi, mikrobiologi, citologi, morfologi, hematologi u.c., papildus parastajai gaismas mikroskopijai izmanto fāzu kontrastu, interferenci, luminiscenci, polarizāciju, stereoskopisko, ultravioleto, infrasarkano mikroskopiju. Šīs metodes ir balstītas uz dažādām gaismas īpašībām. Elektronu mikroskopijā pētāmo objektu attēls parādās elektronu virziena plūsmas dēļ.

Gaismas mikroskopijai un citiem M.m.i., pamatojoties uz to. izšķirošā vērtība papildus izšķirtspējai Mikroskops a ir gaismas stara virziens, kā arī pētāmā objekta pazīmes, kas var būt caurspīdīgas un necaurspīdīgas. Atkarībā no objekta īpašībām mainās gaismas fizikālās īpašības - tā un spilgtums, kas saistīti ar viļņa garumu un amplitūdu, viļņa izplatīšanās plakni un virzienu. Izmantojot šīs gaismas īpašības, tiek veidoti dažādi MMI. Gaismas mikroskopijai bioloģiskos objektus parasti iekrāso, lai atklātu noteiktas to īpašības ( rīsi. 1 ). Šajā gadījumā audi ir jāfiksē, jo atklāj tikai noteiktas nogalināto šūnu struktūras. Dzīvā šūnā krāsviela ir izolēta citoplazmā vakuola veidā un nekrāso tās struktūru. Taču dzīvos bioloģiskos objektus var pētīt arī gaismas mikroskopā, izmantojot vitālās mikroskopijas metodi. Šajā gadījumā tiek izmantots tumšais lauks, kas ir iebūvēts.

Fāzes kontrasta mikroskopija tiek izmantota arī dzīvo un nekrāsotu bioloģisko objektu pētīšanai. Tas ir balstīts uz gaismas stara difrakciju atkarībā no starojuma objekta īpašībām. Tas maina gaismas viļņa garumu un fāzi. īpašā fāzes kontrasta mikroskopā ir caurspīdīga fāzes plāksne. Dzīvi mikroskopiski objekti vai fiksēti, bet nekrāsoti un šūnas, pateicoties to caurspīdīgumam, praktiski nemaina caur tiem ejošā gaismas stara amplitūdu un krāsu. izraisot tikai tā viļņa fāzes nobīdi. Taču, izejot cauri pētāmajam objektam, gaismas stari novirzās no puscaurspīdīgās fāzes plāksnes. Tā rezultātā starp stariem, kas iet caur objektu, un gaismas fona stariem rodas viļņa garuma atšķirība. Ja šī atšķirība ir vismaz 1/4 no viļņa garuma, tad parādās vizuāls efekts, kurā uz gaiša fona ir skaidri redzams tumšs objekts vai otrādi, atkarībā no fāzes plāksnes īpašībām.

Interferences mikroskopija atrisina tās pašas problēmas kā fāzes kontrasts. Bet, ja pēdējais ļauj novērot tikai pētāmo objektu kontūras, tad ar interferences mikroskopijas palīdzību ir iespējams izpētīt caurspīdīga objekta detaļas un veikt to kvantitatīvo analīzi. Tas tiek panākts, pateicoties gaismas stara bifurkācijai mikroskopā: viens no stariem iziet cauri novērotā objekta daļiņai, bet otrs šķērso to. Mikroskopa okulārā abi stari ir savienoti un traucē viens otru. Iegūto fāžu starpību var izmērīt, nosakot so. daudz dažādu šūnu struktūru. Gaismas fāzu starpības secīga mērīšana ar zināmiem refrakcijas rādītājiem ļauj noteikt dzīvo objektu un nefiksētu audu biezumu, ūdens un sausnas koncentrāciju tajos, olbaltumvielu saturu u.c. Pamatojoties uz interferences mikroskopijas datiem, var netieši spriest par pētāmo objektu membrānas caurlaidību, enzīmu aktivitāti un šūnu metabolismu.

Polarizējošā mikroskopija ļauj pētīt pētāmos objektus gaismā, ko veido divi stari, kas polarizēti savstarpēji perpendikulārās plaknēs, t.i. polarizētā gaismā. Šim nolūkam tiek izmantoti plēvveida polaroīdi jeb Nikolasa prizmas, kuras ievieto mikroskopā starp gaismas avotu un preparātu. mainās, izlaižot (vai atstarojot) gaismas starus caur dažādiem strukturālās sastāvdaļasšūnas un audi, kuru īpašības ir neviendabīgas. Tā sauktajās izotropajās struktūrās polarizētās gaismas izplatīšanās ātrums nav atkarīgs no polarizācijas plaknes, anizotropās struktūrās tās izplatīšanās ātrums mainās atkarībā no gaismas virziena pa objekta garenisko vai šķērsasi. Ja gaismas laušanas koeficients gar konstrukciju ir lielāks nekā šķērsvirzienā, pozitīvs divkāršā laušana, ar pretēju sakarību - negatīvu divkāršu laušanu. Daudziem bioloģiskiem objektiem ir stingra molekulārā orientācija, tie ir anizotropi un tiem ir pozitīva gaismas divkārša laušana. Šīs īpašības piemīt miofibrilām, cilijām skropstu epitēlijs, neirofibrillām, kolagēna šķiedrām utt. Polarizētās gaismas staru refrakcijas rakstura un objekta anizotropijas lieluma salīdzinājums ļauj spriest par tā struktūras molekulāro organizāciju ( rīsi. 2 ). Polarizējošā mikroskopija ir viena no histoloģiskās izpētes metodēm (Histoloģiskās izpētes metodes) , ar mikrobioloģiskās diagnostikas metodi (Mikrobioloģiskā diagnostika) , atrod pielietojumu citoloģiskajos pētījumos (citoloģiskajos pētījumos) u.c.. Šādā gadījumā polarizētā gaismā iespējams pētīt gan krāsainus, gan nekrāsotus un nefiksētus, tā sauktos audu sekciju native preparātus.

Plaši tiek izmantota luminiscences mikroskopija. Tas ir balstīts uz noteiktu vielu īpašību dot spīdumu - luminiscenci UV staros vai zili violetajā spektra daļā. Daudzas bioloģiskās vielas, piemēram, vienkāršie, koenzīmi, daži un zāles, ir sava (primārā) luminiscence. Citas vielas sāk spīdēt tikai tad, kad tām tiek pievienotas īpašas krāsvielas - fluorohromi (sekundāri). Fluorohromi var būt difūzi izplatīti šūnā vai arī tie selektīvi krāso atsevišķas šūnu struktūras vai noteiktas ķīmiskie savienojumi bioloģiskais objekts. Tas ir pamats luminiscences mikroskopijas izmantošanai citoloģiskajos un histoķīmiskos pētījumos (sk. Histoķīmiskās izpētes metodes) . Ar imunofluorescences palīdzību luminiscences mikroskopā tiek konstatēti vīrusi un to koncentrācija šūnās, identificēti un noteikti antigēni un hormoni, dažādi vielmaiņas produkti u.c. ( rīsi. 3 ). Šajā sakarā tiek izmantota fluorescences mikroskopija laboratorijas diagnostika tādas infekcijas kā epidēmija, vīrusu, gripa utt., tiek izmantotas ātrai elpceļu diagnostikai vīrusu infekcijas, izmeklējot pacientu deguna gļotādas nospiedumus, un diferenciāldiagnoze dažādas infekcijas. Patomorfoloģijā, izmantojot luminiscences mikroskopiju, tiek atpazīti ļaundabīgi audzēji histoloģiskajos un citoloģiskajos preparātos, noteiktas sirds išēmijas zonas agri datumi miokarda infarkts, konstatēts audu biopsijās u.c.

Ultravioletā mikroskopija balstās uz noteiktu vielu, kas veido dzīvas šūnas, mikroorganismus vai fiksētos, bet nekrāsotos, redzamā gaismā caurspīdīgus audus, spēju absorbēt UV starojumu ar noteiktu viļņa garumu (400-250). nm). Šī īpašība piemīt olbaltumvielām, aromātiskām skābēm (, triptofāns, metilalanija), purīna un piramidīna bāzes u.c. Izmantojot ultravioleto mikroskopiju, tiek precizēta šo vielu lokalizācija un daudzums, bet, pētot dzīvos objektus, to izmaiņas organismā. dzīvībai svarīgās aktivitātes process.

Infrasarkanā mikroskopija ļauj pētīt objektus, kas ir necaurredzami redzamai gaismai un UV starojumam, absorbējot gaismu ar viļņa garumu 750-1200 ar to struktūrām nm... Infrasarkano staru mikroskopijai nav nepieciešama iepriekšēja ķīmiskā apstrāde narkotikas. Šis MM un. visbiežāk izmanto zooloģijā, antropoloģijā un citās bioloģijas nozarēs. Medicīnā infrasarkano staru mikroskopiju galvenokārt izmanto neiromorfoloģijā un oftalmoloģijā.

Lai pētītu tilpuma objektus, tiek izmantota stereoskopiskā mikroskopija. Stereskopisko mikroskopu dizains ļauj redzēt pētāmo objektu ar labo un kreiso aci dažādos leņķos. Izpētiet necaurspīdīgus objektus salīdzinoši zemā palielinājumā (līdz 120 reizēm). Stereoskopisko mikroskopiju izmanto mikroķirurģijā (Microsurgery) , patomorfoloģijā biopsijas, ķirurģiskā un sekciju materiāla speciālajā izpētē, tiesu laboratoriskajos pētījumos.

Elektronu mikroskopiju izmanto, lai pētītu šūnu, mikroorganismu audu un vīrusu struktūru subcelulārā un makromolekulārā līmenī. Šis MM un. ļāva pāriet uz kvalitatīvi jaunu matērijas izpētes līmeni. Viņš atrada plašs pielietojums morfoloģijā, mikrobioloģijā, virusoloģijā, bioķīmijā, onkoloģijā, ģenētikā, imunoloģijā, Strauju elektronu mikroskopa izšķirtspējas pieaugumu nodrošina elektronu plūsma, kas vakuumā iziet cauri elektromagnētiskajiem laukiem, ko rada elektromagnētiskās lēcas. Elektroni var iziet cauri pētāmā objekta struktūrām (transmisijas elektronu mikroskopija) vai atstaroties no tām (skenējošā elektronu mikroskopija), novirzoties dažādos leņķos, kā rezultātā uz mikroskopa luminiscējošā ekrāna parādās attēls. Transmisijas (transmisijas) elektronu mikroskopijā plakans struktūru attēls ( rīsi. 4 ), skenēšanas laikā - tilpuma ( rīsi. 5 ). Elektronu mikroskopijas kombinācija ar citām metodēm, piemēram, radioautogrāfiju, histoķīmisko, imunoloģisko pētījumu metodēm (Imunoloģiskās izpētes metodes) , ļauj veikt elektroniskos radioautogrāfiskos, elektroniskos histoķīmiskos, elektroniskos imunoloģiskos pētījumus.

Elektronu mikroskopijai nepieciešama īpaša izpētes objektu sagatavošana, jo īpaši audu un mikroorganismu ķīmiska vai fiziska fiksācija. Pēc fiksācijas biopsijas materiālu un sekciju materiālu dehidrē, ielej epoksīda sveķos, sagriež ar stikla vai dimanta nažiem uz īpašiem ultratomiem, kas ļauj iegūt īpaši plānas audu sekcijas ar biezumu 30-50 nm... Tie tiek kontrastēti un pēc tam pārbaudīti elektronu mikroskopā. Skenējošā (rastra) elektronu mikroskopā tiek pētītas dažādu objektu virsmas, vakuumkamerā uzsmidzinot uz tiem elektronu blīvas vielas, un tiek apskatītas tā sauktās kopijas, kas atkārto parauga kontūras. Skatīt arī mikroskopu .

Rīsi. 5. Leikocīta un tā fagocitētās baktērijas elektronu difrakcijas modelis, kas iegūts ar skenējošo elektronu mikroskopiju; × 20 000.

1. Mazā medicīnas enciklopēdija. - M .: Medicīnas enciklopēdija. 1991-96 2. Pirmkārt veselības aprūpe... - M .: Lielā krievu enciklopēdija. 1994 3. enciklopēdiskā vārdnīca medicīniskie termini... - M .: Padomju enciklopēdija. - 1982-1984.

• Mikroskopiskā tehnoloģija

Skatiet, kas ir "Mikroskopiskās izpētes metodes" citās vārdnīcās:

Mikroskopiskās izpētes metodes- ekspertīzes objektu pārbaude ar mikroskopu. Ekspertu praksē pētījumi tiek izmantoti caurlaidīgā gaismā, krītošā gaismā (ar gaismas un tumšā lauka metodēm), polarizētā gaismā, ar fāzes kontrasta metodi, ... ... Kriminālistikas enciklopēdija

MEDICĪNAS IZPĒTES METODES - І. Visparīgie principi medicīniskā izpēte. Mūsu zināšanu pieaugums un padziļināšana, arvien vairāk klīnikas tehniskā aprīkojuma, pamatojoties uz izmantošanu jaunākie sasniegumi fizika, ķīmija un tehnoloģijas, ar to saistītā metožu sarežģītība ... ... Lieliska medicīnas enciklopēdija

Arheologi būtībā ir kā detektīvi, kas ir aizņemti ar pagātnes laikmetu cilvēku dzīves atjaunošanu un izpratni; tāpēc nav pārsteidzoši, ka, lai iegūtu informāciju no seno cilvēku atstātajām materiālajām pēdām, viņi izmanto visdažādākos ... ... Koljēra enciklopēdija

I Pacienta izmeklēšana Pacienta izmeklēšana ir pētījumu komplekss, kura mērķis ir noskaidrot pacienta individuālās īpašības, noteikt slimības diagnozi, pamatot racionālu ārstēšanu, noteikt prognozi. Pētījumu apjoms O… Medicīnas enciklopēdija

I Kauls (os) muskuļu un skeleta sistēmas orgāns, kas galvenokārt veidots no kaulaudiem. K. komplekts, savienots (pārtraukti vai nepārtraukti) saistaudi, skrimslis vai kaulu audi, veido skeletu. Kopējā summa K. skelets ...... Medicīnas enciklopēdija

Tas ir balstīts uz patogēna identificēšanu vai pacienta ķermeņa imūnās atbildes reakciju uz to. Sākotnējais posms M.D. ir materiāla atlase un paraugu transportēšana uz laboratoriju. Pētījuma materiāla veidu nosaka īpašības ... ... Medicīnas enciklopēdija

Gaismas mikroskopija

Izmantojot šo metodi, pētnieks darbojas ar šādiem jēdzieniem:

Palielināt– fiziskais īpašums objektīvs un okulārs. Mikroskopa palielinājums tiek aprēķināts kā objektīva palielinājuma un okulāra palielinājuma reizinājums.

Novērojamā objekta minimālais izmērs(d) un mikroskopa izšķirtspēja- vērtības atkarībā no objektīva lēcas īpašībām, viļņa garuma un vides refrakcijas indeksa, kas atdala pētāmo objektu no objektīva vai kondensatora. Palieliniet mikroskopa izšķirtspēju, pielietojot šķidrie līdzekļi(iegremdēšanas medijs), jo to laušanas koeficients ir lielāks par gaisa laušanas koeficientu. Mikroskopijā izmanto eļļas, glicerīna un ūdens iegremdēšanas līdzekļus. Teorētiski iespējams izšķirtspējas robeža gaismas mikroskops - 0,2 mikroni (minimālais attālums, kurā var atšķirt divus objektus).

Īpaši mikroskopijas veidi

Darkfield. Lai izceltu nekrāsotā materiāla kontrastējošās struktūras, tiek izmantots īpašs kondensators. Tumšā lauka mikroskopija ļauj novērot dzīvos objektus. Novērotais objekts izskatās kā apgaismots tumšā laukā. Šajā gadījumā stari no apgaismotāja krīt uz objektu no sāniem, un tikai izkliedēti stari nonāk mikroskopa lēcās.

Fāzes kontrasts mikroskopija ļauj pētīt dzīvos un nekrāsotus objektus. Gaismai ejot cauri krāsainiem objektiem, mainās gaismas viļņa amplitūda, bet, gaismai ejot cauri nekrāsotiem objektiem, mainās gaismas viļņa fāze, ko izmanto, lai iegūtu augsta kontrasta attēlu fāzes kontrasta un traucējumu mikroskopijā.

Polarizējošs mikroskopija - nekrāsotu anizotropu struktūru (piemēram, kolagēna šķiedru un miofibrilu) attēla veidošana.

Traucējumi mikroskopija apvieno fāzes kontrasta un polarizācijas mikroskopijas principus, un to izmanto, lai iegūtu nekrāsotu objektu kontrasta attēlu.

Luminiscējošs mikroskopiju izmanto fluorescējošu (luminiscējošu) objektu novērošanai. Fluorescējošā mikroskopā spēcīga avota gaisma iziet cauri diviem filtriem. Viens filtrs bloķē gaismu parauga priekšā un pārraida tāda viļņa garuma gaismu, kas ierosina parauga fluorescenci. Cits filtrs pārraida fluorescējošā objekta izstarotā viļņa garuma gaismu. Tādējādi fluorescējoši objekti absorbē gaismu vienā viļņa garumā un izstaro citā spektra reģionā.

Fluorescējošās krāsvielas (fluoresceīns, rodamīns utt.) selektīvi saistās ar konkrētām makromolekulām.

Elektronu mikroskopija

Transmisijas EM teorētiskā izšķirtspēja ir 0,002 nm. Mūsdienu mikroskopu reālā izšķirtspēja tuvojas 0,1 nm. Bioloģiskiem objektiem EM izšķirtspēja praksē ir 2 nm.

Caurspīdīgs EM sastāv no kolonnas, caur kuru elektroni, ko izstaro katoda kvēldiegs, iziet vakuumā. Caur sagatavoto paraugu iziet elektronu stars, kas fokusēts ar gredzena magnētiem. Elektronu izkliedes raksturs ir atkarīgs no parauga blīvuma. Elektroni, kas iet cauri paraugam, tiek fokusēti, novēroti fluorescējošā ekrānā un reģistrēti, izmantojot fotoplati.

EM skenēšana izmanto, lai iegūtu pētāmā objekta virsmas trīsdimensiju attēlu.

Čipošanas metode (freeze-chipping) izmanto, lai pētītu iekšējā struktūrašūnu membrānas. Šūnas tiek sasaldētas temperatūrā šķidrais slāpeklis krioprotektora klātbūtnē un izmanto mikroshēmu ražošanai. Šķelšanās plaknes iet caur lipīdu divslāņa hidrofobu vidu. Kaila iekšējā virsma membrānas noēno ar platīnu, iegūtās kopijas pārbauda skenējošā elektronu mikroskopā.