HIV infekcija
HIV infekcija ir cilvēka imūndeficīta vīrusa (HIV) izraisīta slimība, kas ilgstoši saglabājas limfocītos, makrofāgos, nervu audu šūnās, izraisot lēni progresējošus organisma imūndeficīta un nervu sistēmas bojājumus, kas izpaužas sekundāras infekcijas, audzēji, subakūts encefalīts un citas patoloģiskas izmaiņas.
Patogēni - t-tā un 2. tipa cilvēka imūndeficīta vīrusi - HIV-1, HIV-2 (HIV-I, HIV-2, Cilvēka imūndeficīta vīrusi, I, 11. tips) - pieder retrovīrusu saimei, apakšdzimtai lēni vīrusi. Virioni ir sfēriskas daļiņas ar diametru 100-140 nm. Vīrusa daļiņai ir ārējais fosfolipīdu apvalks, kurā ietilpst glikoproteīni (strukturālie proteīni) ar noteiktu molekulmasu, ko mēra kilodaltonos. HIV-1 tie ir gp 160, gp 120, gp 41. Vīrusa iekšējo apvalku, kas pārklāj kodolu, attēlo arī proteīni ar zināmu molekulmasu - p 17, p 24, p 55 (HIV-2 satur gp 140, gp 105, gp 36, p 16, p 25, p 55).
HIV genoms satur RNS un enzīmu reverso transkriptāzi (revertāzi). Lai retrovīrusa genoms savienotos ar saimniekšūnas genomu, DNS vispirms tiek sintezēta uz vīrusa RNS šablona, izmantojot reversetāzi. Pēc tam provīrusa DNS tiek integrēta saimniekšūnas genomā. HIV ir izteikta antigēnu mainība, kas ievērojami pārsniedz gripas vīrusa antigēnu mainīgumu.
Cilvēka organismā HIV galvenais mērķis ir T-limfocīti, kuru virsmā ir vislielākais CD4 receptoru skaits. Pēc HIV iekļūšanas šūnā ar reversetāzes palīdzību vīruss sintezē DNS atbilstoši savas RNS shēmai, kas ir integrēta saimniekšūnas (T-limfocītu) ģenētiskajā aparātā un paliek tur visu mūžu provīrusa stāvoklī. . Papildus T-limfocītiem-palīgiem tiek ietekmēti makrofāgi, B-limfocīti. neirogliālās šūnas, zarnu gļotāda un dažas citas šūnas. T-limfocītu (CD4 šūnu) skaita samazināšanās iemesls ir ne tikai vīrusa tiešā citopātiskā iedarbība, bet arī to saplūšana ar neinficētām šūnām. Līdz ar T-limfocītu sakāvi pacientiem ar HIV infekciju tiek novērota B-limfocītu poliklonālā aktivācija, palielinoties visu klašu imūnglobulīnu, īpaši IgG un IgA, sintēzei un ar sekojošu šīs imūnsistēmas daļas noplicināšanos. . Imūnprocesu regulēšanas traucējumi izpaužas arī kā alfa-interferona, beta-2-mikroglobulīna a līmeņa paaugstināšanās un interleikīna-2 līmeņa pazemināšanās. Imūnsistēmas disfunkcijas rezultātā, īpaši samazinoties T-limfocītu (CD4) skaitam līdz 400 vai mazāk šūnām uz 1 μl asiņu, rodas apstākļi nekontrolētai HIV replikācijai ar ievērojamu virionu skaita pieaugumu. dažādās ķermeņa vidēs. Daudzu imūnsistēmas daļu sakāves rezultātā ar HIV inficēts cilvēks kļūst neaizsargāts pret dažādu infekciju patogēniem. Palielinošās imūnsupresijas foajē attīstās smagas progresējošas slimības, kas cilvēkam ar normāli funkcionējošu imūnsistēmu nenotiek. PVO šīs slimības definēja kā AIDS marķieri (rādītāju).
Pirmā grupa - slimības, kas raksturīgas tikai smagam imūndeficītam (CD4 līmenis zem 200). Klīniskā diagnoze tiek veikta, ja nav anti-HIV antivielu vai HIV antigēnu.
Otrā grupa - slimības, kas attīstās gan uz smaga imūndeficīta fona, gan atsevišķos gadījumos bez tā. Tāpēc šādos gadījumos ir nepieciešama diagnozes laboratoriska apstiprināšana.
Seroloģiskās metodes vīrusu infekciju diagnosticēšanai. Hemaglutinācijas inhibīcija. Citopātiskās iedarbības kavēšana ar vīrusu iejaukšanos. Tiešā imunofluorescence. Imūnelektronu mikroskopija.
Ar vairākumu vīrusu infekcijas attīstīt imūnās atbildes, kas ir pieradušas diagnostika. Šūnu atbildes reakcijas parasti tiek novērtētas, pārbaudot limfocītu citotoksicitāti pret infekcijas izraisītājiem vai ar tiem inficētām mērķa šūnām, vai limfocītu spēju reaģēt uz dažādiem antigēniem un mitogēniem. Praktisko laboratoriju darbā šūnu reakciju smagums tiek noteikts reti. Pretvīrusu AT noteikšanas metodes ir kļuvušas plaši izplatītas.
RN pamatā ir citopatogēnās iedarbības nomākšana pēc vīrusa sajaukšanas ar specifisku AT. Nezināmo vīrusu sajauc ar zināmiem komerciāliem antiserumiem un pēc atbilstošas inkubācijas ievada šūnu monoslānī. Šūnu nāves neesamība norāda uz neatbilstību starp infekcijas izraisītāju un zināmajām antivielām.
Hemaglutinācijas inhibīcija
RTGA izmanto vīrusu identificēšanai spēj aglutinēt dažādus eritrocītus. Lai to paveiktu, patogēnu saturošo barotni sajauc ar zināmu komerciālu antiserumu un ievada šūnu kultūrā. Pēc inkubācijas tiek noteikta kultūras hemaglutinācijas spēja un, ja tās nav, tiek izdarīts secinājums par vīrusa neatbilstību antiserumam.
Citopātiskās iedarbības kavēšana ar vīrusu iejaukšanos
Citopātiskā efekta inhibīcijas reakcija vīrusu iejaukšanās dēļ izmanto, lai identificētu patogēnu, kas traucē zināmu citopatogēnu vīrusu jutīgu šūnu kultūrā. Lai to izdarītu, barotnē, kas satur pētāmo vīrusu, ievada komerciālu serumu (piemēram, masaliņu vīrusam, ja ir aizdomas par to), inkubē un inficē otro kultūru; pēc 1-2 dienām tajā tiek ievadīts zināms citopatogēns vīruss (piemēram, jebkurš ECHO vīruss). Citopatogēnas iedarbības klātbūtnē tiek secināts, ka pirmā kultūra bija inficēta ar vīrusu, kas atbilst pielietotajai AT.
Tiešā imunofluorescence
Starp citiem testiem visplašāk izmantotais tiešā imunofluorescences reakcija(ātrākais, jutīgākais un reproducējamākais). Piemēram, CMV identificēšanai pēc tā citopatogēnās iedarbības ir nepieciešamas vismaz 2-3 nedēļas, un, izmantojot marķētas monoklonālās antivielas, identifikācija iespējama pēc 24 stundām.izmeklēt, izmantojot fluorescējošu mikroskopiju (ļauj noteikt inficēto šūnu fluorescences klātbūtni) .
Imūnelektronu mikroskopija
Imūnelektronu mikroskopija(līdzīgi kā iepriekšējā metode) ļauj identificēt dažāda veida vīrusus, kas atklāti ar elektronu mikroskopiju (piemēram, dažāda veida herpesvīrusiem), ko nevar izdarīt, pamatojoties uz morfoloģiskām pazīmēm. Antiserumu vietā identifikācijai izmanto dažādos veidos marķētos AT, taču metodes sarežģītība un augstās izmaksas ierobežo tās pielietojumu.
119. Seroloģiskie testi, ko izmanto vīrusu infekciju diagnosticēšanai.
Noteikšana asins serumā pacienta antivielas pret patogēna antigēniem ļauj noteikt slimības diagnozi. Seroloģiskie pētījumi tiek izmantoti arī mikrobu antigēnu, dažādu bioloģiski aktīvu vielu, asins grupu, audu un audzēju antigēnu, imūnkompleksu, šūnu receptoru u.c.
Izolējot mikrobu no pacienta patogēnu identificē, pētot tā antigēnās īpašības, izmantojot imūndiagnostikas serumus, t.i., hiperimunizētu dzīvnieku asins serumus, kas satur specifiskas antivielas. Šī t.s seroloģiskā identifikācija mikroorganismiem.
Plaši izmanto mikrobioloģijā un imunoloģijā aglutinācijas, izgulsnēšanās, neitralizācijas reakcijas, reakcijas, kurās iesaistīts komplements, izmantojot marķētas antivielas un antigēnus (radioimunoloģiskās, enzīmu imūnanalīzes, imunofluorescējošās metodes). Uzskaitītās reakcijas atšķiras pēc reģistrētā efekta un stadijas tehnikas, tomēr tās visas ir balstītas uz antigēna mijiedarbības reakciju ar antivielu un tiek izmantotas gan antivielu, gan antigēnu noteikšanai. Imunitātes reakcijas raksturo augsta jutība un specifiskums.
Antivielas un antigēna mijiedarbības pazīmes ir laboratorijas diagnostikas reakciju pamatā. Reakcija in vitro starp antigēnu un antivielu sastāv no specifiskas un nespecifiskas fāzes. V specifiska fāze notiek ātra antivielas aktīvās vietas specifiska saistīšanās ar antigēna determinantu. Tad nāk nespecifiskā fāze - lēnāk, kas izpaužas ar redzamām fizikālām parādībām, piemēram, pārslu veidošanos (aglutinācijas parādība) vai nogulsnēm duļķainības veidā. Šai fāzei nepieciešami noteikti apstākļi (elektrolīti, optimāls barotnes pH).
Antigēna determinanta (epitopa) saistīšanās ar antivielas Fab fragmenta aktīvo vietu ir saistīta ar van der Vālsa spēkiem, ūdeņraža saitēm un hidrofobu mijiedarbību. Antivielu piesaistītā antigēna stiprums un daudzums ir atkarīgs no antivielu afinitātes, aviditātes un to valences.
Uz jautājumu par ekspresdiagnostiku:
1. Var diagnosticēt kultūru, kas izolēta tīrā veidā. 2. Speciāli aprīkotās laboratorijās (jābūt atļaujai) 3. Stingru noteikumu ievērošana, piemēram: izolēta telpa, nepieciešami speciāli aizsargtērpi, obligāta pilnīga telpu sanācija pēc darba ar patogēnu, pētnieku sanitārizācija pēc darba. Ekspresdiagnostikas metodes. 1. Bakterioloģija - kombinētās politropās barotnes ātrai morfu, tinktūras, bioķīmijas izpētei. īpašības. Fermentu indikatorlentes izmantošana, elektrofizikālā metode, ar dažādām vielām (glikozo, laktozi u.c.) piesūcinātu papīra disku metode 2. Fāgu diagnostika. 3. Serodiagnosis - Mancini metode, izgulsnēšanās reakcija gēlā pēc Ascoli, RA, RPGA. 4. Bakterioskopija - tieša un netieša RIF. Ekspress diagnostikas metodes: Holēra - MZ Ermolyeva, imobilizācijas rajons ar holēras diagnostikas serumu, RIF. Tularēmija - RA uz stikla, RPHA Chume - fāgu tipēšana, ogļhidrātu papīra disku metode, RPHA. Sibīrijas mēris - Ascoli metode, RIF, RPGA. Augšanas raksturs: ir trīs difūzie (fakultatīvie anaerobi), gandrīz apakšā (obligātie anaerobi) un virsmas (obligātie aerobi).
Anaerobo baktēriju tīrkultūras izolēšana
Laboratorijas praksē bieži vien ir nepieciešams strādāt ar anaerobiem mikroorganismiem. Tie ir prasīgāki pret barības vielu barotnēm nekā aerobiem, tiem bieži ir nepieciešami īpaši augšanas piedevas, to audzēšanas laikā ir jāpārtrauc skābekļa piegāde, to augšanas periods ir ilgāks. Tāpēc darbs ar viņiem ir sarežģītāks un prasa ievērojamu bakteriologu un laborantu uzmanību.
Materiālu, kas satur anaerobos patogēnus, ir svarīgi aizsargāt no atmosfēras skābekļa toksiskās ietekmes. Tāpēc materiālu no strutojošās infekcijas perēkļiem to punkcijas laikā ieteicams ņemt ar šļirci, laika posmam starp materiāla ņemšanu un sēšanu uz barotnes jābūt pēc iespējas īsākam.
Tā kā anaerobo baktēriju audzēšanai tiek izmantotas īpašas barotnes, kurām nevajadzētu saturēt skābekli un kurām ir zems redokspotenciāls (-20 -150 mV), tad to sastāvā tiek ievadīti indikatori - rezazurīns, metilēnzils un tamlīdzīgi, kas reaģē uz izmaiņas šajā potenciālā. Ar tās augšanu indikatoru bezkrāsainās formas tiek atjaunotas un maina to krāsu: resazurīns krāso vidēji rozā, bet metilēnzils - zils. Šādas izmaiņas liecina par neiespējamību izmantot barotnes anaerobo mikrobu audzēšanai.
Tas palīdz samazināt redokspotenciālu, ievadot barotnē vismaz 0,05% agara, kas, palielinot viskozitāti, palīdz samazināt skābekļa piegādi. To savukārt panāk arī izmantojot svaigu (ne vēlāk kā divas stundas pēc ražošanas) un reducētu barotni.
Jāņem vērā, ka anaerobo baktēriju fermentatīvā vielmaiņas veida īpatnību dēļ tām nepieciešamas uzturvielām un vitamīniem bagātākas barotnes. Visbiežāk tiek izmantoti sirds un smadzeņu un aknu uzlējumi, sojas un rauga ekstrakti, kazeīna hidrolītiskā pārstrāde, peptons, triptons. Ir obligāti jāpievieno augšanas faktori, piemēram, tween-80, hemins, menadions, veselas vai hemolizētas asinis.
Aerobo mikroorganismu tīrkultūras izolēšana sastāv no vairākiem posmiem. Pirmajā dienā (pētījuma 1. posms) patoloģisko materiālu ņem sterilā traukā (mēģenē, kolbā, flakonā). Tiek pētīts izskats, konsistence, krāsa, smarža un citas pazīmes, tiek sagatavota uztriepe, nokrāsota un pārbaudīta mikroskopā. Dažos gadījumos (akūta gonoreja, mēris) šajā posmā ir iespējams veikt iepriekšēju diagnozi un papildus izvēlēties barotnes, uz kurām materiāls tiks sēts. Paņēmu ar bakterioloģisko cilpu (lieto visbiežāk), ar lāpstiņu pēc Drygalsky metodes, ar vates-marles tamponu. Krūzes ir aizvērtas, apgrieztas otrādi, parakstītas ar speciālu zīmuli un ievietotas termostatā optimālā temperatūrā (37 ° C) uz 18-48 gadiem. Posma mērķis ir iegūt izolētas mikroorganismu kolonijas. Tomēr dažreiz, lai materiālu sakrautu kaudzēs, to sēj uz šķidrām barotnēm.
No aizdomīgām kolonijām tiek sagatavotas uztriepes, kas iekrāsotas ar Grama metodi, lai pētītu patogēnu morfoloģiskās un nokrāsu īpašības, un mobilās baktērijas tiek izmeklētas “nokarenā” vai “saspiestā” pilē. Šīm pazīmēm ir ārkārtīgi liela diagnostiskā vērtība noteiktu mikroorganismu veidu raksturošanā. Izpētīto koloniju atliekas rūpīgi noņem no barotnes virsmas, nepieskaroties pārējām, un inokulē uz slīpa agara vai Petri trauciņa sektoros ar barotni, lai iegūtu tīrkultūru. Mēģenes vai traukus ar labību ievieto termostatā optimālā temperatūrā 18-24 stundas.
Uz šķidrām barotnēm baktērijas var augt arī savādāk, lai gan augšanas izpausmju pazīmes ir sliktākas nekā uz cietām.
Baktērijas spēj izraisīt barotnes difūzu duļķainību, savukārt tās krāsa var nemainīties vai iegūt pigmenta krāsu. Šo augšanas modeli visbiežāk novēro lielākajā daļā fakultatīvo anaerobo mikroorganismu.
Dažreiz caurules apakšā veidojas nogulsnes. Tas var būt drupans, viendabīgs, viskozs, gļotains utt. Virs tā esošā vide var palikt caurspīdīga vai kļūt duļķaina. Ja mikrobi neveido pigmentu, nogulsnēm ir dzīva vai dzeltenīga krāsa. Parasti anaerobās baktērijas aug līdzīgā secībā.
Sienu augšana izpaužas, veidojot pārslas, graudus, kas piestiprināti pie mēģenes iekšējām sienām. Vide paliek caurspīdīga.
Aerobās baktērijas mēdz augt uz virsmas. Bieži vien uz virsmas veidojas smalka bezkrāsaina vai zilgana plēvīte tikko pamanāma pārklājuma veidā, kas pazūd, barotni nokratot vai maisot. Plēve var būt mitra, bieza, adītas, gļotainas konsistences un pielīp pie cilpas, tai stiepjas. Tomēr ir arī blīva, sausa, trausla plēve, kuras krāsa ir atkarīga no pigmenta, ko ražo mikroorganismi.
Ja nepieciešams, izveido uztriepi, iekrāso, izmeklē mikroskopā un mikroorganismus iesēj ar cilpu uz blīvas barotnes virsmas, lai iegūtu izolētas kolonijas.
Trešajā dienā (pētījuma 3. posms) tiek pētīta mikroorganismu tīrkultūras augšanas būtība un veikta tās identificēšana.
Pirmkārt, uzmanība tiek pievērsta mikroorganismu augšanas īpašībām uz barotnes un tiek veikta uztriepe, krāsojot to ar Grama metodi, lai pārbaudītu kultūras tīrību. Ja mikroskopā tiek novērotas vienāda veida morfoloģijas, izmēra un tinctorial (spēja krāsoties) baktērijas, tiek secināts, ka kultūra ir tīra. Dažos gadījumos jau pēc to augšanas izskata un īpašībām var izdarīt secinājumu par izolēto patogēnu veidu. Baktēriju sugu noteikšanu pēc to morfoloģiskajām pazīmēm sauc par morfoloģisko identifikāciju. Patogēnu veida noteikšanu pēc to kultūras pazīmēm sauc par kultūras identifikāciju.
Tomēr ar šiem pētījumiem nepietiek, lai izdarītu galīgo secinājumu par izolēto mikrobu veidu. Tāpēc viņi pēta baktēriju bioķīmiskās īpašības. Tie ir diezgan dažādi.
Visbiežāk tiek pētītas saharolītiskās, proteolītiskās, peptolītiskās, hemolītiskās īpašības, dekarboksilāzes, oksidāzes, katalāzes, plazmakoagulāzes, DNāzes, fibrinolizīna enzīmu veidošanās, nitrātu redukcijas līdz nitrītiem un tamlīdzīgi. Šim nolūkam ir paredzētas īpašas uzturvielu barotnes, kas tiek inokulētas ar mikroorganismiem (raibās Hiss sērijas, MPB, rūgušpiena sūkalas, piens utt.).
Patogēna veida noteikšanu pēc tā bioķīmiskajām īpašībām sauc par bioķīmisko identifikāciju.
TĪRĀS BAKTĒRIJU KULTŪRAS AUDZĒŠANAS METODES UN IZOLĒŠANA Veiksmīgai kultivēšanai papildus pareizi izvēlētai barotnei un pareizi veiktai inokulācijai nepieciešami optimāli apstākļi: temperatūra, mitrums, aerācija (gaisa padeve). Anaerobu audzēšana ir grūtāka nekā aerobu audzēšana, gaisa izvadīšanai no barības vides tiek izmantotas dažādas metodes. Atsevišķu baktēriju veidu (tīrkultūras) izolēšana no testa materiāla, kas parasti satur dažādu mikroorganismu maisījumu, ir viens no jebkura bakterioloģiskā pētījuma posmiem. Tīra mikrobu kultūra tiek iegūta no izolētas mikrobu kolonijas. Izolējot tīrkultūru no asinīm (hemokultūru), tā tiek provizoriski “augšana” šķidrā vidē: 100–150 ml šķidras barotnes inokulē 10–15 ml sterilu asiņu. Iesēto asiņu un barības barotnes attiecība 1:10 nav nejauša – šādi tiek panākta asins atšķaidīšana (neatšķaidītām asinīm ir kaitīga ietekme uz mikroorganismiem). Baktēriju tīrkultūras izolēšanas posmi I posms (vietējais materiāls) Mikroskopija (aptuvena mikrofloras priekšstats). Sēšana uz blīvām barotnēm (koloniju iegūšana). II stadija (izolētas kolonijas) Koloniju (baktēriju kultūras īpašību) izpēte. Mikroskopiskā mikrobu izpēte krāsotā uztriepē (baktēriju morfoloģiskās īpašības). Inokulācija uz barības vielu agara slīpi, lai izolētu tīrkultūru. III stadija (tīrkultūra) Kultūras, morfoloģisko, bioķīmisko un citu īpašību noteikšana baktēriju kultūras identifikācijai BAKTĒRIJU IDENTIFIKĀCIJA Izolētu baktēriju kultūru identificēšana tiek veikta, pētot baktēriju morfoloģiju, to kultūras, bioķīmiskās un citas katrai raksturīgās īpašības. sugas.
Tas pamatojas uz pretvīrusu antivielu noteikšanu pacienta asinīs seroloģiskās reakcijās, izmantojot specifiskus vīrusu antigēnus – diagnostikas vai īpašas testu sistēmas. Seroloģiskās reakcijas vīrusu infekciju gadījumā tiek ievietotas šķidrā vidē (RSK, RTGA, RNGA, RONGA, RTONGA, RIA), gēlā (RPG, RRG, RVIEF) vai uz cietas fāzes nesēja (piemēram, uz sienām). polistirola plāksnes iedobe ar vienas no imūnās atbildes komponentiem - antigēna vai antivielas fiksāciju). Ir zināmas tādas cietās fāzes metodes kā ELISA, IEM, RGadsTO, RIF, RGads, RTGads.
Bieži vien, ņemot vērā dabisko pretvīrusu antivielu klātbūtni vairumā veselīgu cilvēku asinīs, vīrusu infekciju seroloģiskā diagnoze balstās uz pētījumu. sapārotie serumi, kas tiek ņemti slimības sākumā un laikā vai atveseļošanās periodā, lai noteiktu antivielu titra pieaugumu. Antivielu titra palielināšanās četras vai vairāk reizes tiek uzskatīta par diagnostiski nozīmīgu.
Seroloģisko metožu jutīguma paaugstināšana tiek panākta ar antigēnu vai antivielu adsorbciju uz eritrocītiem (RNGA, RONGA, RTONGA, RGadsTO, RRG), kas marķēti ar fermentiem (ELISA), radioaktīviem izotopiem (RIA, RPG) vai fluorohromiem (RIF), Princips eritrocītu sabrukšanu izmanto arī (kā indikatoru sistēmas) antigēnu un antivielu mijiedarbības laikā komplementa (RSK, RRG) klātbūtnē.
Komplementa fiksācijas reakcija (CFR) komplementa fiksācijas veidā aukstumā (nakts laikā +4 0 C temperatūrā) bieži izmanto virusoloģijā vairāku vīrusu infekciju retrospektīvai diagnostikai un vīrusam specifisku antigēnu noteikšanai pacientu materiālos. .
Radiālās hemolīzes reakcija (RRH) agarozes gēlā ir balstīts uz eritrocītu hemolīzes fenomenu, kas sensibilizēts ar antigēnu vīrusam specifisku antivielu ietekmē komplementa klātbūtnē un tiek izmantots gripas, ARVI, masaliņu, cūciņu un togavīrusa infekciju seroloģiskai diagnostikai.
Lai izveidotu reakciju, aitas eritrocītiem pievieno 0,1 ml neatšķaidīta vīrusa antigēna (0,3 ml 10% suspensijas) un maisījumu inkubē 10 minūtes istabas temperatūrā. 1,2% agarozei 42 0 C temperatūrā pievieno 0,3 ml sensibilizēto eritrocītu un 0,1 ml komplementa, maisījumu lej uz stikla priekšmetstikliņiem vai polistirola plākšņu iedobēs, sasaldētajā agarozes gēlā ar aparātu izgriež caurumus. perforē un piepilda ar pētītajiem un kontroles serumiem. Brilles vai paneļus aizver ar vāku un ievieto mitrā kamerā uz 16-18 stundām termostatā. Reakcijas uzskaite tiek veikta atbilstoši hemolīzes zonas diametram ap caurumiem, kas piepildīti ar serumu. Kontrolē hemolīzes nav.
Laboratorijas diagnostika
UDC-078
Vīrusu infekciju laboratoriskā diagnostika
N.N. Nosiks, V.M. Stahanovs
Virusoloģijas institūts. DI. Ivanovska RAMS, Maskava
Vīrusu infekciju laboratoriskā diagnostika
N.N. Nosiks, V.M. Stačanova
Ievads
Vīrusu slimību ārstēšanas un profilakses iespēju paplašināšana, izmantojot pretvīrusu medikamentus, imūnmodulatorus un vakcīnas ar dažādu darbības mehānismu, nepieciešama ātra un precīza laboratoriskā diagnostika. Dažu pretvīrusu līdzekļu šaura specifika prasa arī ātru un ļoti specifisku infekcijas izraisītāja diagnozi. Lai uzraudzītu pretvīrusu terapiju, bija nepieciešamas kvantitatīvas metodes vīrusu noteikšanai. Papildus slimības etioloģijas noteikšanai laboratoriskā diagnostika ir svarīga pretepidēmijas pasākumu organizēšanā.
Pirmo epidēmisko infekciju gadījumu savlaicīga diagnostika ļauj savlaicīgi īstenot pretepidēmijas pasākumus – karantīnu, hospitalizāciju, vakcināciju u.c. Infekcijas slimību, piemēram, baku, likvidēšanas programmu īstenošana ir parādījusi, ka, tos īstenojot, liela nozīme ir laboratoriskā diagnostika palielinās. Būtiska loma asins dienestā un dzemdību praksē ir laboratoriskajai diagnostikai, piemēram, inficēto donoru identificēšanai. cilvēka imūndeficīta vīruss(HIV), B hepatīta vīruss (HBV), masaliņu un citomegalovīrusa infekcijas diagnostika grūtniecēm.
Diagnostikas metodes
Ir trīs galvenās pieejas vīrusu infekciju laboratoriskai diagnostikai (1. tabula, 2. tabula):
1) materiāla tieša pārbaude vīrusa antigēna vai nukleīnskābju klātbūtnei;
2) vīrusa izolēšana un identificēšana no klīniskā materiāla;
3) seroloģiskā diagnoze, kuras pamatā ir būtiska vīrusa antivielu palielināšanās slimības gaitā.
Izmantojot jebkuru izvēlēto pieeju vīrusu diagnostikai, viens no svarīgākajiem faktoriem ir pārbaudāmā materiāla kvalitāte. Tātad, piemēram, tiešai parauga analīzei vai vīrusa izolācijai, testa materiāls jāiegūst pašā slimības sākumā, kad patogēns joprojām izdalās salīdzinoši lielos daudzumos un vēl nav saistīts ar antivielām, un parauga apjomam jābūt pietiekamam tiešai izpētei. Svarīgi ir arī izvēlēties materiālu atbilstoši iespējamajai slimībai, tas ir, materiālu, kurā, pamatojoties uz infekcijas patoģenēzi, vīrusa klātbūtnes iespējamība ir vislielākā.
Svarīga loma veiksmīgā diagnostikā ir videi, kurā materiāls tiek ņemts, kā tas tiek transportēts un kā tas tiek uzglabāts. Tātad, nazofaringijas vai taisnās zarnas uztriepes, pūslīšu saturu ievieto barotnē, kas satur proteīnu, kas novērš ātru vīrusa infekciozitātes zudumu (ja tiek plānota izolācija), vai atbilstošā buferšķīdumā (ja plānots strādāt ar nukleīnskābēm ).
Tiešās metodes klīniskā materiāla diagnosticēšanai
Tiešās metodes ir metodes, kas ļauj noteikt vīrusu, vīrusa antigēnu vai vīrusu nukleīnskābe(NC) tieši klīniskajā materiālā, tas ir, tie ir ātrākie (2-24 stundas). Tomēr, ņemot vērā vairākas patogēnu pazīmes, tiešajām metodēm ir ierobežojumi (iespēja iegūt viltus pozitīvus un viltus negatīvus rezultātus). Tāpēc tie bieži vien ir jāapstiprina ar netiešām metodēm.
Elektronu mikroskopija (EM). Izmantojot šo metodi, jūs varat noteikt īsto vīrusu. Veiksmīgai vīrusa noteikšanai tā koncentrācijai paraugā jābūt aptuveni 1,10 6 daļiņām uz 1 ml. Bet, tā kā patogēna koncentrācija pacientu materiālā parasti ir nenozīmīga, vīrusa meklēšana ir sarežģīta un prasa tā iepriekšēju nogulsnēšanos, izmantojot ātrgaitas centrifugēšanu, kam seko negatīva krāsošana. Turklāt EM neļauj tipizēt vīrusus, jo daudziem no tiem ģimenē nav morfoloģisku atšķirību. Piemēram, herpes simplex, citomegalovīrusa vai herpes zoster vīrusi morfoloģiski praktiski nav atšķirami.
Viens no diagnostikas nolūkos izmantotajiem EM variantiem ir imūnā elektronu mikroskopija(IEM), kurā tiek izmantotas specifiskas antivielas pret vīrusiem. Antivielu mijiedarbības rezultātā ar vīrusiem veidojas kompleksi, kas pēc negatīvas iekrāsošanās ir vieglāk nosakāmi.
IEM ir nedaudz jutīgāks par EM un tiek izmantots, ja vīrusu nevar kultivēt. in vitro, piemēram, meklējot vīrusu hepatīta patogēnus.
Imunofluorescences reakcija (RIF). Metodes pamatā ir antivielu izmantošana, kas saistītas ar krāsvielu, piemēram, fluoresceīna izotiocianātu. RIF tiek plaši izmantots vīrusu antigēnu noteikšanai pacientu materiālos un ātrai diagnostikai.
Praksē tiek izmantoti divi RIF varianti: taisni un netiešs. Pirmajā gadījumā tiek izmantotas ar krāsvielām iezīmētas antivielas pret vīrusiem, kuras tiek uzklātas uz inficētajām šūnām (uztriepe, šūnu kultūra). Tādējādi reakcija notiek vienā solī. Metodes neērtības ir nepieciešamība pēc liela konjugētu specifisku serumu komplekta ar daudziem vīrusiem.
Netiešajā RIF variantā testa materiālam tiek uzklāts specifisks serums, kura antivielas saistās ar vīrusa antigēnu, kas atrodas materiālā, un pēc tam pretsugas serums tiek uzklāts uz dzīvnieka gamma globulīniem, kuros. tika sagatavots specifiskais imūnserums, piemēram, anti-trušu, pretzirgu utt. Priekšrocība RIF netiešais variants sastāv no nepieciešamības pēc tikai viena veida marķētas antivielas.
RIF metodi plaši izmanto, lai ātri atšifrētu akūtu elpceļu vīrusu infekciju etioloģiju, analizējot uztriepes-nospiedumus no augšējo elpceļu gļotādas. Veiksmīga RIF izmantošana tiešai vīrusa noteikšanai klīniskajā materiālā ir iespējama tikai tad, ja tajā ir pietiekami liels inficēto šūnu skaits un nenozīmīgs piesārņojums ar mikroorganismiem, kas var radīt nespecifisku luminiscenci.
Enzīmu imūnanalīze (ELISA). Enzīmu imūnanalīzes metodes vīrusu antigēnu noteikšanai principā ir līdzīgas RIF, taču to pamatā ir antivielu marķēšana ar fermentiem, nevis krāsvielām. Visplašāk izmanto mārrutku peroksidāzi un sārmaino fosfatāzi, izmanto arī β-galaktozidāzi un β-laktamāzes. Iezīmētās antivielas saistās ar antigēnu, un šāds komplekss tiek noteikts, pievienojot substrātu fermentam, ar kuru antivielas ir konjugētas. Reakcijas galaprodukts var būt nešķīstošu nogulšņu veidā, un pēc tam skaitīšanu veic, izmantojot parasto gaismas mikroskopu, vai šķīstoša produkta veidā, kas parasti ir krāsains (vai var fluorescēt vai luminiscēt) un ierakstīts instrumentāli.
Tā kā šķīstošos antigēnus var izmērīt ar ELISA palīdzību, paraugā nav vajadzīgas neskartas šūnas, un tādējādi var izmantot dažāda veida klīniskos materiālus.
Vēl viena svarīga ELISA metodes priekšrocība ir antigēnu kvantitatīvās noteikšanas iespēja, kas ļauj ar to novērtēt slimības klīnisko gaitu un ķīmijterapijas efektivitāti. ELISA, tāpat kā RIF, var izmantot gan tiešā, gan netiešā veidā.
Vislielākais sadalījums ir cietās fāzes ELISA, kas dod šķīstošu krāsainu reakcijas produktu. ELISA var izmantot gan antigēna noteikšanai (pēc tam antivielas tiek uzklātas uz cietās fāzes - polistirola plāksnes iedobes dibenu), gan antivielu noteikšanai (pēc tam antigēnus uzliek cietajai fāzei).
Radioimūntests (RIA) . Metodes pamatā ir antivielu marķēšana ar radioizotopiem, kas nodrošina augstu jutību vīrusa antigēna noteikšanā. Metode kļuva plaši izplatīta pagājušā gadsimta astoņdesmitajos gados, īpaši HBV un citu nekultivējamu vīrusu marķieru noteikšanai. Metodes trūkumi ietver nepieciešamību strādāt ar radioaktīvām vielām un dārgu iekārtu (gamma skaitītāju) izmantošanu.
Molekulārās metodes. Sākotnēji ļoti specifiskā NA hibridizācijas metode tika uzskatīta par klasisku vīrusu genoma noteikšanas metodi, bet tagad vīrusa genomu izolēšana, izmantojot polimerāzes ķēdes reakcija(PCR).
Nukleīnskābju molekulārā hibridizācija. Metode pamatojas uz komplementāru DNS vai RNS virkņu hibridizāciju ar divpavedienu struktūru veidošanos un to noteikšanu, izmantojot etiķeti. Šim nolūkam tiek izmantotas īpašas DNS vai RNS zondes, kas marķētas ar izotopu (32 P) vai biotīnu, kas nosaka komplementāras DNS vai RNS virknes. Ir vairāki metodes varianti: - punktveida hibridizācija - izolēta un denaturēta NA tiek uzklāta uz filtriem un pēc tam tiek pievienota iezīmēta zonde; rezultātu norādīšana - autoradiogrāfija, izmantojot 32 R vai krāsošana - ar avidīnu-biotīnu; - blota hibridizācija - metode ar restrikcijas endonukleāzēm izgrieztu NA fragmentu izolēšanai no kopējās DNS un pārnesti uz nitrocelulozes filtriem un pārbaudīti ar iezīmētām zondēm; izmanto kā apstiprinošu HIV infekcijas testu; - hibridizācija in situ– ļauj noteikt NK inficētajās šūnās.
PCR pamatojoties uz dabiskās DNS replikācijas principu. Metodes būtība sastāv no vīrusam specifiskas DNS sekvences sintēzes (amplifikācijas) ciklu atkārtotas atkārtošanas, izmantojot termostabilu Taq DNS polimerāzi un divus specifiskus praimerus, tā sauktos primerus.
Katrs cikls sastāv no trim posmiem ar dažādiem temperatūras apstākļiem. Katrā ciklā sintezētā reģiona kopiju skaits tiek dubultots. Jaunsintezētie DNS fragmenti kalpo kā šablons jaunu virkņu sintēzei nākamajā amplifikācijas ciklā, kas ļauj 25–35 ciklos uzkrāt pietiekamu skaitu izvēlētā DNS reģiona kopiju tā noteikšanai, parasti ar agarozes gelu. elektroforēze.
Metode ir ļoti specifiska un ļoti jutīga. Tas ļauj testa materiālā noteikt vairākas vīrusa DNS kopijas. Pēdējos gados PCR arvien vairāk tiek izmantots vīrusu infekciju (hepatīta vīrusi, herpes vīrusi, citomegalovīrusi, papilomas uc) diagnostikai un uzraudzībai.
Ir izstrādāts kvantitatīvās PCR variants, kas ļauj noteikt amplificētās DNS vietas kopiju skaitu. Tehnika ir sarežģīta, dārga un vēl nav pietiekami vienota ikdienas lietošanai.
citoloģiskās metodes pašlaik ir ierobežota diagnostiskā vērtība, taču tie joprojām ir jāizmanto vairāku infekciju gadījumos. Tiek pārbaudīti autopsijas materiāli, biopsijas, uztriepes, kuras pēc atbilstošas apstrādes tiek iekrāsotas un analizētas mikroskopā. Citomegalovīrusa infekcijā, piemēram, audu sekcijās vai urīnā tiek atrastas raksturīgas milzu šūnas - "pūces acs", ar trakumsērgu - ieslēgumi šūnu citoplazmā (Babes-Negri ķermeņi). Dažos gadījumos, piemēram, hroniska hepatīta diferenciāldiagnozē, svarīgs ir aknu audu stāvokļa novērtējums.
Bezmaksas krievu-vācu tekstu tulkojums tiešsaistē
Noteikumi lasīšanai rumāņu valodā
Kvalitatīvs tulkojums no krievu valodas armēņu un citās valodās
Krievu-maru tiešsaistes tulkotājs un vārdnīca
Bezmaksas krievu-vācu tekstu tulkojums tiešsaistē