अप्रत्यक्ष (निष्क्रिय) रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (RNGA) इस तथ्य पर आधारित है कि एरिथ्रोसाइट्स, यदि एक घुलनशील प्रतिजन को उनकी सतह पर अधिशोषित किया जाता है, तो अधिशोषित प्रतिजन के प्रति एंटीबॉडी के साथ अंतःक्रिया करते समय एग्लूटीनेट करने की क्षमता प्राप्त कर लेते हैं। RNGA आरेख अंजीर में दिखाया गया है। 34. कई संक्रमणों के निदान में RNGA का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

चावल। 34. निष्क्रिय रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (RPHA) की योजना। ए - एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम प्राप्त करना: बी - आरपीएचए: 1 - एरिथ्रोसाइट: 2 - एंटीजन का अध्ययन किया; 3 - एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम; 4 - अध्ययन किए गए प्रतिजन के प्रति एंटीबॉडी: 5 - एग्लूटीनेट

प्रतिक्रिया का बयान। परीक्षण सीरम को ५६ डिग्री सेल्सियस पर ३० मिनट के लिए गर्म किया जाता है, १:१० - १:१२८० के अनुपात में क्रमिक रूप से पतला और 0.25 मिलीलीटर ट्यूब या कुओं में डाला जाता है, जहां फिर एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम की 2 बूंदें डाली जाती हैं (एंटीजन के साथ एरिथ्रोसाइट्स पर adsorbed उन्हें)।

नियंत्रण: ज्ञात प्रतिरक्षा सीरम के साथ एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम का निलंबन; सामान्य सीरम के साथ डायग्नोस्टिकम का निलंबन; परीक्षण किए गए सीरम के साथ सामान्य एरिथ्रोसाइट्स का निलंबन। पहले नियंत्रण में एग्लूटिनेशन होना चाहिए, दूसरे और तीसरे में यह नहीं होना चाहिए।

रीगा की मदद से, एक अज्ञात एंटीजन का निर्धारण किया जा सकता है यदि ज्ञात एंटीबॉडी को एरिथ्रोसाइट्स पर अधिशोषित किया जाता है।

ताकाची माइक्रोटिटर का उपयोग करके हेमाग्लगुटिनेशन प्रतिक्रिया 0.025 मिलीलीटर (माइक्रोमेथोड) की मात्रा में सेट की जा सकती है।

नियंत्रण प्रश्न

1. एरिथ्रोसाइट्स और वायरस की उपस्थिति के लिए परीक्षण की गई सामग्री के बीच सकारात्मक आरएचए परिणाम क्या दर्शाता है?

2. क्या एरिथ्रोसाइट्स का एग्लूटिनेशन तब होगा जब वायरस और संबंधित सीरम को उनमें मिला दिया जाए? इस घटना को प्रकट करने वाली प्रतिक्रिया का नाम क्या है?

व्यायाम

खाते में लें और रीगा के परिणाम को पंजीकृत करें।

शीघ्र प्रतिक्रिया

वर्षा की प्रतिक्रिया में, एक विशिष्ट प्रतिरक्षा परिसर अवक्षेपित होता है, जिसमें घुलनशील एंटीजन (लाइसेट, अर्क, हैप्टेन) और इलेक्ट्रोलाइट्स की उपस्थिति में एक विशिष्ट एंटीबॉडी होता है।

परिणामी बादल वलय या अवक्षेप को अवक्षेप कहा जाता है। एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया से, यह प्रतिक्रिया मुख्य रूप से एंटीजन कणों के आकार में भिन्न होती है।

वर्षा प्रतिक्रिया का उपयोग आमतौर पर कई संक्रमणों (एंथ्रेक्स, मेनिन्जाइटिस, आदि) के निदान में एंटीजन को निर्धारित करने के लिए किया जाता है; फोरेंसिक चिकित्सा में - रक्त, शुक्राणु आदि की प्रजातियों का निर्धारण करने के लिए; स्वच्छता और स्वच्छ अनुसंधान में - उत्पादों के मिथ्याकरण की स्थापना करते समय; इसकी सहायता से जंतुओं और पौधों के फाईलोजेनेटिक संबंध निर्धारित होते हैं। प्रतिक्रिया के लिए आपको चाहिए:

1. एंटीबॉडी (प्रीसिपिटिन) - एंटीबॉडी के उच्च टिटर के साथ प्रतिरक्षा सीरम (1: 100000 से कम नहीं)। अवक्षेपण सीरम का अनुमापांक उस प्रतिजन के उच्चतम तनुकरण से निर्धारित होता है जिसके साथ वह प्रतिक्रिया करता है। सीरम आमतौर पर undiluted या 1: 5 - 1:10 कमजोर पड़ने पर उपयोग किया जाता है।

2. प्रतिजन - एक प्रोटीनयुक्त या लिपोइड-पॉलीसेकेराइड प्रकृति के विलेय (पूर्ण प्रतिजन और हैप्टेंस)।

3. आइसोटोनिक समाधान।

अवक्षेपण अभिक्रिया करने की मुख्य विधियाँ वलय अवक्षेपण अभिक्रिया और अग्र (जेल) में अवक्षेपण अभिक्रिया हैं।

ध्यान! वर्षा की प्रतिक्रिया में शामिल सभी घटक पूरी तरह से पारदर्शी होने चाहिए।

रिंग वर्षा प्रतिक्रिया... सीरम का 0.2-0.3 मिली (5-6 बूंद) एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके वर्षा ट्यूब में जोड़ा जाता है (सीरम ट्यूब की दीवारों पर नहीं गिरना चाहिए)। प्रतिजन सावधानी से एक ही मात्रा में सीरम पर स्तरित होता है, इसे टेस्ट ट्यूब की दीवार के साथ एक पतली पाश्चर पिपेट के साथ डालना। उसी समय, परखनली को झुकी हुई स्थिति में रखा जाता है। उचित लेयरिंग के साथ, सीरम और एंटीजन के बीच एक स्पष्ट सीमा बनाई जानी चाहिए। परखनली को सावधानी से एक रैक में रखें ताकि तरल पदार्थ न मिलें। यदि प्रतिक्रिया सकारात्मक है, तो एंटीजन और एंटीबॉडी की सीमा पर एक अशांत "रिंग" बनता है - एक अवक्षेप (चित्र 48 देखें)।

प्रतिक्रिया के बाद कई नियंत्रण होते हैं (तालिका 18)। टेस्ट ट्यूब में प्रतिक्रिया सामग्री जोड़ने का क्रम बहुत महत्वपूर्ण है। सीरम को एंटीजन (नियंत्रण में - आइसोटोनिक समाधान पर) पर रखना असंभव है, क्योंकि सीरम का सापेक्ष घनत्व अधिक है, यह टेस्ट ट्यूब के नीचे तक डूब जाएगा, और तरल पदार्थ के बीच की सीमा नहीं होगी प्रकट होना।

तालिका 18. वलय वर्षा की प्रतिक्रिया के मंचन की योजना

ध्यान दें। + एक "रिंग" की उपस्थिति; - "रिंग" की कमी।

परिणाम 5-30 मिनट के बाद दर्ज किए जाते हैं, कुछ मामलों में एक घंटे के बाद, हमेशा की तरह, नियंत्रण से शुरू होते हैं। दूसरी टेस्ट ट्यूब में "रिंग" प्रतिरक्षा सीरम की संबंधित एंटीजन के साथ एक विशिष्ट प्रतिक्रिया में प्रवेश करने की क्षमता को इंगित करता है। 3-5 वीं टेस्ट ट्यूब में कोई "रिंग" नहीं होना चाहिए - कोई संबंधित एंटीबॉडी और एंटीजन नहीं हैं। पहली टेस्ट ट्यूब में एक "रिंग" - प्रतिक्रिया का सकारात्मक परिणाम - इंगित करता है कि परीक्षण किया गया एंटीजन लिया गया प्रतिरक्षा सीरम से मेल खाता है, "रिंग" (केवल दूसरी टेस्ट ट्यूब में "रिंग") की अनुपस्थिति उनके संकेत देती है विसंगति - प्रतिक्रिया का एक नकारात्मक परिणाम।

आगर (जेल) वर्षा प्रतिक्रिया... प्रतिक्रिया की ख़ासियत यह है कि एंटीजन और एंटीबॉडी की बातचीत घने माध्यम में होती है, यानी जेल में। परिणामी अवक्षेप माध्यम के थोक में एक टर्बिड बैंड देता है। एक बैंड की अनुपस्थिति प्रतिक्रिया घटकों के बीच एक बेमेल का संकेत देती है। इस प्रतिक्रिया का व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से, डिप्थीरिया के प्रेरक एजेंट में विष निर्माण के अध्ययन में।

नियंत्रण प्रश्न

1. एग्लूटिनेशन और अवक्षेपण प्रतिक्रियाओं के बीच मुख्य अंतर क्या है?

2. अवक्षेपण अभिक्रिया में मेघयुक्त अवयवों का उपयोग क्यों नहीं किया जा सकता है?

व्यायाम

1. वलय अवक्षेपण अभिक्रिया सेट करें और परिणाम को स्केच करें।

2. अगर में वर्षा प्रतिक्रिया में एंटीबॉडी के साथ एंटीजन की बातचीत की प्रकृति का अध्ययन करें, परिणाम को स्केच करें (शिक्षक से एक कप प्राप्त करें)।

Lysis प्रतिक्रिया (प्रतिरक्षा साइटोलिसिस)

प्रतिरक्षा लसीका पूरक की अनिवार्य भागीदारी के साथ एंटीबॉडी के प्रभाव में कोशिकाओं का विघटन है। प्रतिक्रिया के लिए आपको चाहिए:

1. एंटीजन - रोगाणु, लाल रक्त कोशिकाएं या अन्य कोशिकाएं।

2. एंटीबॉडी (लाइसिन) - प्रतिरक्षा सीरम, कम बार रोगी का सीरम। बैक्टीरियोलाइटिक सीरम में बैक्टीरिया के विश्लेषण में शामिल एंटीबॉडी होते हैं; हेमोलिटिक - हेमोलिसिन, जो एरिथ्रोसाइट्स के लसीका को बढ़ावा देता है; स्पाइरोकेट्स के विश्लेषण के लिए, स्पाइरोकेटोलिसिन की आवश्यकता होती है, कोशिकाओं - इटोलिसिन, आदि।

3. पूरक। गिनी सूअरों के सीरम में अधिकांश पूरक। यह सीरम (कई जानवरों का मिश्रण) आमतौर पर पूरक के रूप में उपयोग किया जाता है। ताजा (देशी) पूरक अस्थिर है और आसानी से गर्म, मिलाते हुए, भंडारण से नष्ट हो जाता है, इसलिए आप इसे प्राप्त करने के दो दिनों से अधिक समय तक उपयोग नहीं कर सकते। पूरक को संरक्षित करने के लिए इसमें 2% बोरिक एसिड और 3% सोडियम सल्फेट मिलाया जाता है। इस पूरक को 4 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। शुष्क पूरक अक्सर उपयोग किया जाता है। उपयोग करने से पहले, यह मूल मात्रा (लेबल पर इंगित) के लिए एक आइसोटोनिक समाधान में भंग कर दिया जाता है।

4. आइसोटोनिक समाधान।

हेमोलिसिस प्रतिक्रिया(तालिका 19)। प्रतिक्रिया के लिए आपको चाहिए:

1. एंटीजन - एरिथ्रोसाइट तलछट के 0.3 मिलीलीटर और आइसोटोनिक समाधान के 9.7 मिलीलीटर की दर से धुली भेड़ एरिथ्रोसाइट्स का 3% निलंबन।

2. एंटीबॉडी - भेड़ एरिथ्रोसाइट्स के खिलाफ हेमोलिटिक सीरम (हेमोलिसिन); आमतौर पर उत्पादन में तैयार, lyophilized और अनुमापांक लेबल पर इंगित किया गया है।

हेमोलिसिन टिटर उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने वाला है जिस पर पूरक की उपस्थिति में एरिथ्रोसाइट्स के 3% निलंबन का पूर्ण हेमोलिसिस होता है। हेमोलिसिस प्रतिक्रिया के लिए, हेमोलिसिन को ट्रिपल टिटर में लिया जाता है, अर्थात यह टिटर से पहले की तुलना में 3 गुना कम पतला होता है। उदाहरण के लिए, 1: 1200 के सीरम टिटर के साथ, सीरम को 1: 400 (सीरम का 0.1 मिली * और आइसोटोनिक घोल का 39.9 मिली) पतला किया जाता है। हेमोलिसिन की अधिकता आवश्यक है, क्योंकि इसमें से कुछ को प्रतिक्रिया के अन्य घटकों द्वारा अधिशोषित किया जा सकता है।

* (0.1 मिली से कम सीरम न लें - माप सटीकता प्रभावित होती है।)

3. पूरक 1:10 (पूरक के 0.2 मिलीलीटर और आइसोटोनिक समाधान के 1.8 मिलीलीटर) पतला है।

4. आइसोटोनिक समाधान।

तालिका 19. हेमोलिसिस प्रतिक्रिया की योजना

परिणामों के लिए लेखांकन। यदि प्रतिक्रिया सही ढंग से सेट की जाती है, तो पहली टेस्ट ट्यूब में हेमोलिसिस होगा - इसकी सामग्री पारदर्शी हो जाएगी। नियंत्रण में, तरल बादल रहता है: हेमोलिसिस की शुरुआत के लिए दूसरी टेस्ट ट्यूब में, पूरक की कमी है, तीसरे में - कोई हेमोलिसिन नहीं है, चौथे में - न तो हेमोलिसिन है और न ही पूरक, 5 वें में - एंटीजन एंटीबॉडी के अनुरूप नहीं है,

यदि आवश्यक हो, तो हेमोलिटिक सीरम को निम्नलिखित योजना (तालिका 20) के अनुसार शीर्षक दिया जाता है।

अनुमापन से पहले, सीरम 1: 100 (सीरम का 0.1 मिली और आइसोटोनिक घोल का 9.9 मिली) का प्रारंभिक कमजोर पड़ना तैयार करें, जिससे आवश्यक कमजोरियाँ बनाई जाती हैं, उदाहरण के लिए:

इन तनुकरणों से, 0.5 मिली सीरम अनुमापन प्रयोग की परखनलियों में मिलाया जाता है, जैसा कि तालिका में दिखाया गया है। बीस.

तालिका 20. हेमोलिटिक सीरम (हेमोलिसिन) के अनुमापन की योजना

तालिका में दिखाए गए उदाहरण में। 20, हेमोलिटिक सीरम का अनुमापांक 1: 1200 है।

ताजा हेमोलिटिक सीरम का उपयोग करते समय, इसमें मौजूद पूरक को नष्ट करने के लिए इसे निष्क्रिय किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, इसे 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में या थर्मोस्टैट के साथ एक निष्क्रियकर्ता में गरम किया जाता है। अंतिम विधि बेहतर है: यह मट्ठा के अधिक गरम होने की संभावना को बाहर करता है, अर्थात। इसका विकृतीकरण। विकृत सीरा परीक्षण के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

बैक्टीरियोलिसिस प्रतिक्रिया... इस प्रतिक्रिया में, पूरक एक उपयुक्त (समरूप) सीरम की उपस्थिति में बैक्टीरिया को नष्ट कर देता है। प्रतिक्रिया योजना मूल रूप से हेमोलिसिस प्रतिक्रिया योजना के समान है। अंतर यह है कि दो घंटे के ऊष्मायन के बाद, सभी ट्यूबों को पेट्री डिश पर एक माध्यम के साथ टीका लगाया जाता है जो प्रयोग में लिए गए सूक्ष्मजीव के लिए अनुकूल होता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि यह लाइस्ड है या नहीं। एक सही ढंग से निर्धारित प्रयोग के साथ, 2-5 ट्यूबों (नियंत्रण) से टीकाकरण में प्रचुर वृद्धि होनी चाहिए। पहली टेस्ट ट्यूब (प्रयोग) से टीकाकरण में वृद्धि की अनुपस्थिति या कमजोर वृद्धि रोगाणुओं की मृत्यु का संकेत देती है, अर्थात वे एंटीबॉडी के समरूप हैं।

ध्यान! बैक्टीरियोलिसिस प्रतिक्रिया सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में की जानी चाहिए।

नियंत्रण प्रश्न

1. यदि आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान के बजाय आसुत जल का उपयोग किया जाता है तो एरिथ्रोसाइट्स का क्या होता है? इस घटना के पीछे क्या है?

2. जब एरिथ्रोसाइट्स पूरक के अभाव में समजातीय प्रतिरक्षा सीरम के साथ परस्पर क्रिया करते हैं तो क्या प्रतिक्रिया होगी?

व्यायाम

हेमोलिसिस प्रतिक्रिया सेट करें। परिणाम को कैप्चर और स्केच करें।

इसी तरह की जानकारी।

यह इस तथ्य पर आधारित है कि एरिथ्रोसाइट्स, जिन पर एंटीजन पहले से अधिशोषित होते हैं, समजातीय सीरा (एंटीबॉडी) की उपस्थिति में एग्लूटीनेट करने की क्षमता प्राप्त कर लेते हैं।

इस मामले में, एरिथ्रोसाइट्स विशिष्ट निर्धारकों के साथ वाहक के रूप में कार्य करते हैं, जिनमें से एग्लूटीनेशन एंटीजन + एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप होता है।

एरिथ्रोसाइट्स, जिसकी सतह पर एंटीजन मजबूती से जुड़े होते हैं, एरिथ्रोसाइट एंटीजेनिक डायग्नोस्टिकम कहलाते हैं, या एरिथ्रोसाइट्स एक एंटीजन के साथ संवेदी होते हैं।

एक अन्य प्रकार का आरएनजीए - एंटीबॉडी एरिथ्रोसाइट्स की सतह पर सोख लिया जाता है और उनका बाद में एग्लूटीनेशन एक समरूप प्रतिजन की उपस्थिति में होता है। इस मामले में, ऐसे एरिथ्रोसाइट्स को एरिथ्रोसाइट एंटीबॉडी डायग्नोस्टिकम कहा जाता है, या एरिथ्रोसाइट्स एंटीबॉडी के साथ संवेदनशील होते हैं।

इन दो मौलिक कार्यप्रणाली दृष्टिकोणों के आधार पर, आरएनजीए के कई संशोधनों को विकसित किया गया है और उनका उपयोग किया जाता है। इस प्रकार, छोटे मानक लेटेक्स कणों को वाहक के रूप में उपयोग किया जाता है। इस मामले में, प्रतिक्रिया को लेटेक्स एग्लूटिनेशन रिएक्शन (आरएलए) कहा जाता है या स्टैफिलोकोकस ऑरियस का उपयोग किया जाता है - जमावट प्रतिक्रिया, आदि। आमतौर पर, एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिक्स जैविक उद्योग के उद्यमों में तैयार किए जाते हैं, और नैदानिक ​​​​प्रयोगशालाओं में वे पहले से ही मुख्य डालते हैं आरएनजीए का अनुभव।

एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिक्स की तैयारी में निम्नलिखित चरण शामिल हैं:

• फॉर्मलाडेहाइड या ग्लूटारल, या ऐक्रेलिक एल्डिहाइड के साथ एरिथ्रोसाइट्स का निर्धारण। इस तरह के संसाधित एरिथ्रोसाइट्स लंबे समय तक बने रहते हैं। इस उद्देश्य के लिए अक्सर राम, मनुष्यों, मुर्गियों आदि के एरिथ्रोसाइट्स का उपयोग किया जाता है;
• टैनिन समाधान के साथ निश्चित एरिथ्रोसाइट्स का उपचार। नतीजतन, एरिथ्रोसाइट्स उनकी सतह पर अपरिवर्तनीय रूप से सोखने वाले प्रोटीन (वायरस और एंटीबॉडी) की संपत्ति प्राप्त कर लेते हैं;
• वायरस या एंटीबॉडी के साथ प्रतिबंधित एरिथ्रोसाइट्स का संवेदीकरण।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वायरल संक्रमण के लिए एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिक्स तैयार करने के तरीके अलग-अलग हैं।

एंटीबॉडी टिटर का पता लगाने और निर्धारण के लिए आरएनजीए स्थापित करने की तकनीक इस प्रकार है:

• प्रतिजन-संवेदी एरिथ्रोसाइट्स की समान खुराक सीरम के सीरियल 2-गुना कमजोर पड़ने में जोड़ दी जाती है;
• मिश्रण को कमरे के तापमान पर 2-3 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए छोड़ दिया जाता है;
• परिणामों को ध्यान में रखें। यदि सीरम में वायरस के प्रति एंटीबॉडी होते हैं, जो एरिथ्रोसाइट्स को संवेदनशील बनाते हैं, तो रक्तगुल्म देखा जाता है, जिसका मूल्यांकन क्रॉस में किया जाता है।

सीरम में एंटीबॉडी के अनुमापांक के लिए, सीरम का उच्चतम तनुकरण लिया जाता है, जो अभी भी कम से कम दो क्रॉस द्वारा रक्तगुल्म प्रदान करता है।

RNGA सभी प्रासंगिक नियंत्रणों के साथ है। आमतौर पर, प्रतिक्रिया माइक्रोमेथोड द्वारा की जाती है।

RNGA आपको निम्नलिखित नैदानिक ​​कार्यों को हल करने की अनुमति देता है:

• एंटीबॉडी का पता लगाना और एक ज्ञात एरिथ्रोसाइट एंटीजेनिक डायग्नोस्टिकम का उपयोग करके रक्त सीरम में उनके अनुमापांक का निर्धारण करना;
• एक ज्ञात एरिथ्रोसाइट एंटीबॉडी डायग्नोस्टिकम का उपयोग करके एक अज्ञात वायरस का पता लगाना और उसकी पहचान करना।

RNGA के लाभ: उच्च संवेदनशीलता, सेटिंग तकनीक की सरलता और त्वरित प्रतिक्रिया। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि स्थिर एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिक्स की तैयारी में बड़ी कठिनाइयां हैं (उपयोग किए गए घटकों की शुद्धता पर बड़ी निर्भरता, एक निर्धारण मोड का चयन करने की आवश्यकता, प्रत्येक प्रकार के वायरस के लिए एरिथ्रोसाइट्स का तनीकरण और संवेदीकरण)।

अप्रत्यक्ष या निष्क्रिय रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (RPHA)

यह प्रतिक्रिया एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया की तुलना में अधिक संवेदनशील होती है और इसका उपयोग बैक्टीरिया, रिकेट्सिया, प्रोटोजोआ और अन्य सूक्ष्मजीवों के कारण होने वाले संक्रमण के निदान में किया जाता है।

RPHA एंटीबॉडी की एक छोटी एकाग्रता का पता लगाता है।

इस प्रतिक्रिया में समूह I रक्त के साथ टैन्ड लैम्ब एरिथ्रोसाइट्स या मानव एरिथ्रोसाइट्स शामिल हैं, जो एंटीजन या एंटीबॉडी के साथ संवेदनशील हैं।

यदि परीक्षण सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है, तो एंटीजन के साथ संवेदनशील एरिथ्रोसाइट्स का उपयोग किया जाता है (एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम)।

कुछ मामलों में, यदि परीक्षण सामग्री में विभिन्न एंटीजन को निर्धारित करना आवश्यक है, तो प्रतिरक्षा ग्लोब्युलिन द्वारा संवेदनशील एरिथ्रोसाइट्स का उपयोग किया जाता है।

RPHA के परिणामों को एरिथ्रोसाइट तलछट की प्रकृति द्वारा ध्यान में रखा जाता है।

प्रतिक्रिया का परिणाम सकारात्मक माना जाता है, जिसमें लाल रक्त कोशिकाएं समान रूप से टेस्ट ट्यूब (उल्टे छतरी) के पूरे तल को कवर करती हैं।

एक नकारात्मक प्रतिक्रिया के मामले में, एक छोटी डिस्क (बटन) के रूप में लाल रक्त कोशिकाएं टेस्ट ट्यूब के नीचे के केंद्र में स्थित होती हैं।

एग्लूटिनेशन टेस्ट (आरए)

इसकी विशिष्टता, मंचन और प्रदर्शन की सादगी के कारण, कई संक्रामक रोगों के निदान के लिए सूक्ष्मजीवविज्ञानी अभ्यास में एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया व्यापक हो गई है: टाइफाइड और पैराटाइफाइड बुखार (विडाल की प्रतिक्रिया), टाइफस (वीगल की प्रतिक्रिया), आदि।

एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया पूरे माइक्रोबियल या अन्य कोशिकाओं (एग्लूटीनोजेन्स) के साथ एंटीबॉडी (एग्लूटीनिन) की बातचीत की विशिष्टता पर आधारित होती है। इस बातचीत के परिणामस्वरूप, कण बनते हैं - एग्लोमेरेट्स जो अवक्षेप (एग्लूटिनेट) करते हैं।

दोनों जीवित और मारे गए बैक्टीरिया, स्पाइरोकेट्स, कवक, प्रोटोजोआ, रिकेट्सिया, साथ ही एरिथ्रोसाइट्स और अन्य कोशिकाएं एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया में भाग ले सकती हैं।

प्रतिक्रिया दो चरणों में होती है: पहला (अदृश्य) - विशिष्ट, एंटीजन और एंटीबॉडी का संयोजन, दूसरा (दृश्यमान) - गैर-विशिष्ट, एंटीजन का ग्लूइंग, अर्थात। एग्लूटिनेट गठन।

एग्लूटीनेट तब बनता है जब एक द्विसंयोजक एंटीबॉडी का एक सक्रिय केंद्र एक एंटीजन के निर्धारक समूह में शामिल हो जाता है।

एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया, किसी भी सीरोलॉजिकल प्रतिक्रिया की तरह, इलेक्ट्रोलाइट्स की उपस्थिति में आगे बढ़ती है।

बाह्य रूप से, सकारात्मक एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया की अभिव्यक्ति दुगनी होती है। फ्लैगेलेट रोगाणुओं में जिनमें केवल एक दैहिक ओ-एंटीजन होता है, माइक्रोबियल कोशिकाएं स्वयं सीधे पालन करती हैं। इस एग्लूटिनेशन को महीन दाने वाला कहा जाता है। यह 18 - 22 घंटे के भीतर होता है।

फ्लैगेलेट रोगाणुओं में दो एंटीजन होते हैं - सोमैटिक ओ-एंटीजन और फ्लैगेलर एच-एंटीजन। यदि कोशिकाएं कशाभिका के साथ चिपक जाती हैं, तो बड़े ढीले गुच्छे बनते हैं और इस समूहन प्रतिक्रिया को मोटे दाने वाले कहा जाता है। यह 2 से 4 घंटे के भीतर होता है।

एग्लूटीनेशन रिएक्शन को रोगी के रक्त सीरम में विशिष्ट एंटीबॉडी के गुणात्मक और मात्रात्मक निर्धारण के उद्देश्य से और पृथक रोगज़नक़ की प्रजातियों को निर्धारित करने के उद्देश्य से निर्धारित किया जा सकता है। रक्तगुल्म सूक्ष्मजीवविज्ञानी संक्रामक

एग्लूटिनेशन रिएक्शन को एक विस्तारित संस्करण में सेट किया जा सकता है, जिससे आप डायग्नोस्टिक टिटर के लिए पतला सीरम के साथ काम कर सकते हैं, और एक ओरिएंटेशन रिएक्शन के निर्माण में, जो सिद्धांत रूप में, आपको विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने या प्रजातियों का निर्धारण करने की अनुमति देता है। रोगाणु।

लगभग सभी संक्रामक रोगों का प्रयोगशाला निदान रोगी के रक्त में एंटीबॉडी का पता लगाने पर आधारित होता है, जो रोगज़नक़ के प्रतिजनों के खिलाफ, सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं के तरीकों से उत्पन्न होते हैं। उन्होंने उन्नीसवीं सदी के उत्तरार्ध से - बीसवीं शताब्दी की शुरुआत में चिकित्सा पद्धति में प्रवेश किया।

विज्ञान के विकास ने रोगाणुओं की एंटीजेनिक संरचना और उनके विषाक्त पदार्थों के रासायनिक सूत्रों को निर्धारित करने में मदद की है। इससे न केवल चिकित्सीय, बल्कि नैदानिक ​​सीरा भी बनाना संभव हो गया। वे प्रयोगशाला जानवरों को कमजोर रोगजनकों को पेश करके प्राप्त किए जाते हैं। कई दिनों के एक्सपोजर के बाद, खरगोशों या चूहों के खून से तैयारी तैयार की जाती है, जिसका उपयोग सीरोलॉजिकल परीक्षणों का उपयोग करके रोगाणुओं या उनके विषाक्त पदार्थों की पहचान के लिए किया जाता है।

इस तरह की प्रतिक्रिया की बाहरी अभिव्यक्ति इसकी सेटिंग और रोगी के रक्त में एंटीजन की स्थिति पर निर्भर करती है। यदि माइक्रोबियल कण अघुलनशील होते हैं, तो वे सीरम में अवक्षेपित, लाइसे, बाँध या स्थिर हो जाते हैं। यदि एंटीजन घुलनशील हैं, तो निष्प्रभावी या वर्षा की घटना प्रकट होती है।

एग्लूटिनेशन टेस्ट (आरए)

सीरोलॉजिकल एग्लूटिनेशन रिएक्शन अत्यधिक विशिष्ट है। यह निष्पादन में सरल है और रोगी के रक्त सीरम में एंटीजन की उपस्थिति को शीघ्रता से निर्धारित करने के लिए पर्याप्त स्पष्ट है। इसका उपयोग विडाल प्रतिक्रिया (टाइफाइड और पैराटाइफाइड बुखार का निदान) और वीगल (टाइफस) के मंचन के लिए किया जाता है।

यह मानव एंटीबॉडी (या एग्लूटीनिन) और माइक्रोबियल कोशिकाओं (एग्लूटीनोजेन्स) के बीच एक विशिष्ट बातचीत पर आधारित है। उनकी बातचीत के बाद, कण बनते हैं, जो अवक्षेपित होते हैं। यह एक सकारात्मक संकेत है। प्रतिक्रिया के मंचन के लिए, जीवित या मारे गए माइक्रोबियल एजेंट, कवक, प्रोटोजोआ और दैहिक कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है।

प्रतिक्रिया रासायनिक रूप से दो चरणों में टूट जाती है:

1. एंटीजन (एजी) के साथ एंटीबॉडी (एटी) का विशिष्ट संबंध।
2. गैर-विशिष्ट - एजी-एटी समूह की वर्षा, यानी एग्लूटीनेट का गठन।

अप्रत्यक्ष समूहन प्रतिक्रिया (RPHA)

इसकी सेटिंग के लिए, शुद्ध भेड़ के एरिथ्रोसाइट्स और मानव लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, एंटीबॉडी या एंटीजन के साथ इलाज किया जाता है (यह इस बात पर निर्भर करता है कि प्रयोगशाला सहायक वास्तव में क्या खोजना चाहता है)। कुछ मामलों में, मानव लाल रक्त कोशिकाओं का इलाज इम्युनोग्लोबुलिन के साथ किया जाता है। एरिथ्रोसाइट्स की सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाएं मान्य मानी जाती हैं यदि वे ट्यूब के नीचे जमा हो जाती हैं। एक सकारात्मक प्रतिक्रिया कहा जा सकता है जब कोशिकाओं को एक उल्टे छतरी के रूप में व्यवस्थित किया जाता है, जो पूरे तल पर कब्जा कर लेता है। एक नकारात्मक प्रतिक्रिया की गणना की जाती है यदि लाल रक्त कोशिकाएं एक स्तंभ में या नीचे के केंद्र में एक बटन के रूप में बस गई हैं।

वर्षा प्रतिक्रिया (आरपी)

इस प्रकार के सीरोलॉजिकल परीक्षण एंटीजन के अत्यंत छोटे कणों का पता लगाने का काम करते हैं। ये हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, प्रोटीन (या उनके हिस्से), लिपिड या कार्बोहाइड्रेट के साथ प्रोटीन के यौगिक, बैक्टीरिया के हिस्से, उनके विषाक्त पदार्थ।

प्रतिक्रिया के लिए सीरम जानवरों, आमतौर पर खरगोशों के कृत्रिम संक्रमण द्वारा प्राप्त किया जाता है। इस विधि का उपयोग बिल्कुल किसी भी अवक्षेपण सीरम को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। सीरोलॉजिकल वर्षा प्रतिक्रियाओं की सेटिंग एग्लूटीनेशन प्रतिक्रियाओं की क्रिया के तंत्र में समान है। सीरम में निहित एंटीबॉडी एंटीजन के साथ मिलकर बड़े प्रोटीन अणु बनाते हैं, जो ट्यूब के नीचे या एक सब्सट्रेट (जेल) पर जमा होते हैं। यह विधि अत्यधिक विशिष्ट मानी जाती है और किसी पदार्थ की नगण्य मात्रा का भी पता लगा सकती है।

इसका उपयोग प्लेग, टुलारेमिया, एंथ्रेक्स, मेनिन्जाइटिस और अन्य बीमारियों के निदान के लिए किया जाता है। इसके अलावा, वह फोरेंसिक चिकित्सा परीक्षा में शामिल है।

जेल में

सीरोलॉजिकल परीक्षण न केवल एक तरल माध्यम में, बल्कि एक अगर जेल में भी किए जा सकते हैं। इसे विसरित अवक्षेपण विधि कहते हैं। इसकी मदद से जटिल एंटीजेनिक मिश्रणों की संरचना का अध्ययन किया जाता है। यह विधि एंटीबॉडी के प्रतिजनों के कीमोटैक्सिस पर आधारित है और इसके विपरीत। जेल में, वे अलग-अलग गति से एक-दूसरे की ओर बढ़ते हैं और मिलते हुए, वर्षा रेखाएँ बनाते हैं। प्रत्येक पंक्ति एजी-एटी का एक सेट है।

एंटीटॉक्सिन (आरएन) के साथ एक्सोटॉक्सिन के बेअसर होने की प्रतिक्रिया

एंटीटॉक्सिक सीरम सूक्ष्मजीवों द्वारा उत्पादित एक्सोटॉक्सिन के प्रभाव को बेअसर करने में सक्षम हैं। ये सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाएं इसी पर आधारित हैं। माइक्रोबायोलॉजी इस पद्धति का उपयोग सीरा, विषाक्त पदार्थों और टॉक्सोइड्स के साथ-साथ उनकी चिकित्सीय गतिविधि को निर्धारित करने के लिए करती है। टॉक्सिन न्यूट्रलाइजेशन की ताकत पारंपरिक इकाइयों - एई द्वारा निर्धारित की जाती है।

इसके अलावा, इस प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद, प्रजातियों या एक्सोटॉक्सिन के प्रकार को निर्धारित करना संभव है। इसका उपयोग डिप्थीरिया, बोटुलिज़्म के लिए किया जाता है। अध्ययन "कांच पर" और एक जेल दोनों में किया जा सकता है।

Lysis प्रतिक्रिया (RL)

रोगी के शरीर में प्रवेश करने वाले प्रतिरक्षा सीरम में निष्क्रिय प्रतिरक्षा के अपने मुख्य कार्य के अलावा, लाइसिंग गुण भी होते हैं। यह रोगी के शरीर में प्रवेश करने वाले माइक्रोबियल एजेंटों, सेलुलर विदेशी तत्वों और वायरस को भंग करने में सक्षम है। सीरम में शामिल एंटीबॉडी की विशिष्टता के आधार पर, बैक्टीरियोलिसिन, साइटोलिसिन, स्पिरोचेटोलिसिन, हेमोलिसिन और अन्य को अलग किया जाता है।

इन विशिष्ट एंटीबॉडी को पूरक कहा जाता है। यह लगभग सभी शरीर के तरल पदार्थों में पाया जाता है, इसकी एक जटिल प्रोटीन संरचना होती है और यह तापमान वृद्धि, झटकों, एसिड और सीधी धूप के प्रति बेहद संवेदनशील होती है। लेकिन सूखे अवस्था में, यह छह महीने तक अपने लाइटिक गुणों को बनाए रखने में सक्षम है।

इस प्रकार की सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाएं होती हैं:

बैक्टीरियोलिसिस;

हेमोलिसिस।

जीवित रोगाणुओं के साथ रोगी के रक्त सीरम और विशिष्ट प्रतिरक्षा सीरम का उपयोग करके बैक्टीरियोलिसिस किया जाता है। यदि रक्त में पर्याप्त मात्रा में पूरक है, तो शोधकर्ता बैक्टीरिया के लसीका को देखेगा, और प्रतिक्रिया को सकारात्मक माना जाएगा।

रक्त की दूसरी सीरोलॉजिकल प्रतिक्रिया यह है कि रोगी के एरिथ्रोसाइट्स के निलंबन को सीरम युक्त हेमोलिसिन के साथ इलाज किया जाता है, जो केवल एक निश्चित प्रशंसा की उपस्थिति में सक्रिय होते हैं। यदि कोई है, तो प्रयोगशाला सहायक लाल रक्त कोशिकाओं के विघटन का निरीक्षण करता है। यह प्रतिक्रिया आधुनिक चिकित्सा में व्यापक रूप से रक्त सीरम में पूरक के अनुमापांक (यानी, एरिथ्रोसाइट्स के लसीका को उत्तेजित करने वाली सबसे छोटी राशि) को निर्धारित करने और एक पूरक बाध्यकारी परख करने के लिए उपयोग की जाती है। यह इस प्रकार है कि उपदंश के लिए एक सीरोलॉजिकल प्रतिक्रिया की जाती है -

पूरक निर्धारण प्रतिक्रिया (सीबीसी)

इस प्रतिक्रिया का उपयोग रोगी के रक्त सीरम में एक संक्रामक एजेंट के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने के साथ-साथ इसकी एंटीजेनिक संरचना द्वारा रोगज़नक़ की पहचान करने के लिए किया जाता है।

इस बिंदु तक, हमने सरल सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं का वर्णन किया है। सीएससी को एक जटिल प्रतिक्रिया माना जाता है, क्योंकि इसमें दो नहीं, बल्कि तीन तत्व परस्पर क्रिया करते हैं: एंटीबॉडी, एंटीजन और पूरक। इसका सार इस तथ्य में निहित है कि एंटीबॉडी और एंटीजन के बीच बातचीत केवल तारीफ प्रोटीन की उपस्थिति में होती है, जो गठित एजी-एटी कॉम्प्लेक्स की सतह पर adsorbed होते हैं।

प्रतिजन स्वयं, पूरक के अतिरिक्त होने के बाद, महत्वपूर्ण परिवर्तनों से गुजरते हैं, जो प्रतिक्रिया की गुणवत्ता दिखाते हैं। यह लसीका, हेमोलिसिस, स्थिरीकरण, जीवाणुनाशक या बैक्टीरियोस्टेटिक क्रिया हो सकती है।

प्रतिक्रिया स्वयं दो चरणों में होती है:

1. एक एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स का निर्माण, जो शोधकर्ता को दिखाई नहीं देता है।
2. पूरक के प्रभाव में प्रतिजन परिवर्तन। इस चरण का अक्सर नग्न आंखों से पता लगाया जा सकता है। यदि प्रतिक्रिया नेत्रहीन दिखाई नहीं दे रही है, तो परिवर्तनों की पहचान करने के लिए एक अतिरिक्त संकेतक प्रणाली का उपयोग किया जाता है।

संकेतक प्रणाली

यह प्रतिक्रिया पूरक बंधन पर आधारित है। शुद्ध राम एरिथ्रोसाइट्स और हेमोलिटिक सीरम, जिसमें पूरक नहीं होता है, आरएससी की स्थापना के एक घंटे बाद टेस्ट ट्यूब में जोड़ा जाता है। यदि टेस्ट ट्यूब में अनबाउंड पूरक रहता है, तो यह मेमने की रक्त कोशिकाओं और हेमोलिसिन के बीच बने एजी-एटी कॉम्प्लेक्स में शामिल हो जाएगा और उन्हें भंग कर देगा। इसका मतलब यह होगा कि आरएसके नकारात्मक है। यदि लाल रक्त कोशिकाएं बरकरार रहती हैं, तो, तदनुसार, प्रतिक्रिया सकारात्मक होती है।

रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (HA)

दो मौलिक रूप से अलग-अलग रक्तगुल्म प्रतिक्रियाएं हैं। उनमें से एक सीरोलॉजिकल है, इसका उपयोग रक्त समूहों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस मामले में, लाल रक्त कोशिकाएं एंटीबॉडी के साथ बातचीत करती हैं।

और दूसरी प्रतिक्रिया सीरोलॉजिकल पर लागू नहीं होती है, क्योंकि लाल रक्त कोशिकाएं वायरस द्वारा उत्पादित हेमाग्लगुटिनिन के साथ प्रतिक्रिया करती हैं। चूंकि प्रत्येक रोगज़नक़ केवल विशिष्ट एरिथ्रोसाइट्स (चिकन, भेड़ का बच्चा, बंदर) पर कार्य करता है, इस प्रतिक्रिया को अत्यधिक विशिष्ट माना जा सकता है।

ट्यूब के नीचे रक्त कोशिकाओं के स्थान से आप समझ सकते हैं कि प्रतिक्रिया सकारात्मक है या नकारात्मक। अगर इनका पैटर्न उल्टे छाते जैसा दिखता है, तो मरीज के खून में वांछित वायरस मौजूद होता है। और अगर सभी एरिथ्रोसाइट्स एक सिक्के के स्तंभ की तरह बन गए हैं, तो कोई रोगजनकों की तलाश नहीं है।

रक्तगुल्म निषेध प्रतिक्रिया (RTGA)

यह एक अत्यधिक विशिष्ट प्रतिक्रिया है जो आपको रोगी के रक्त सीरम में प्रकार, प्रकार के वायरस या विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति स्थापित करने की अनुमति देती है।

इसका सार इस तथ्य में निहित है कि परीक्षण सामग्री के साथ टेस्ट ट्यूब में जोड़े गए एंटीबॉडी एरिथ्रोसाइट्स पर एंटीजन के जमाव को रोकते हैं, जिससे रक्तगुल्म रुक जाता है। यह एक विशिष्ट लक्ष्य वायरस के लिए रक्त में विशिष्ट एंटीजन की उपस्थिति का गुणात्मक संकेत है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया (आरआईएफ)

प्रतिक्रिया फ्लोरोक्रोम रंगों के उपचार के बाद एजी-एटी परिसरों का पता लगाने की क्षमता पर आधारित है। इस पद्धति का उपयोग करना आसान है, शुद्ध संस्कृति के अलगाव की आवश्यकता नहीं है और इसमें बहुत कम समय लगता है। संक्रामक रोगों के स्पष्ट निदान के लिए यह अनिवार्य है।

व्यवहार में, इन सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं को दो प्रकारों में विभाजित किया जाता है: प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष।

डायरेक्ट आरआईएफ एक एंटीजन के साथ निर्मित होता है जिसे फ्लोरोसेंट सीरम के साथ दिखाया गया है। और परोक्ष रूप से, दवा को पहले एक पारंपरिक डायग्नोस्टिक किट के साथ इलाज किया जाता है जिसमें वांछित एंटीबॉडी के लिए एंटीजन होते हैं, और फिर ल्यूमिनसेंट सीरम, जो एजी-एटी कॉम्प्लेक्स के प्रोटीन के लिए विशिष्ट होता है, को फिर से लगाया जाता है, और माइक्रोस्कोपी के तहत माइक्रोबियल कोशिकाएं दिखाई देती हैं।

यह एरिथ्रोसाइट्स या तटस्थ सिंथेटिक सामग्री (उदाहरण के लिए, लेटेक्स कण) का उपयोग करता है, जिसकी सतह पर एंटीजन (बैक्टीरिया, वायरल, ऊतक) या एंटीबॉडी को सॉर्ब किया जाता है। उनका एग्लूटीनेशन तब होता है जब उपयुक्त सीरा या एंटीजन जोड़े जाते हैं। एंटीजन के साथ संवेदनशील एरिथ्रोसाइट्स को एंटीजेनिक एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम कहा जाता है और एंटीबॉडी का पता लगाने और उनका उपयोग करने के लिए उपयोग किया जाता है। एंटीबॉडी संवेदनशील एरिथ्रोसाइट्स। इम्युनोग्लोबुलिन एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम कहा जाता है और एंटीजन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है।

निष्क्रिय रक्तगुल्म प्रतिक्रिया का उपयोग बैक्टीरिया (टाइफाइड और पैराटाइफाइड बुखार, पेचिश, ब्रुसेलोसिस, प्लेग, हैजा, आदि), प्रोटोजोआ (मलेरिया) और वायरस (इन्फ्लूएंजा, एडेनोवायरस संक्रमण, वायरल हेपेटाइटिस बी, खसरा, टिक-) के कारण होने वाले रोगों के निदान के लिए किया जाता है। जनित एन्सेफलाइटिस, क्रीमियन रक्तस्रावी बुखार, आदि), साथ ही कुछ हार्मोन निर्धारित करने के लिए, दवाओं और हार्मोन, जैसे पेनिसिलिन और इंसुलिन के लिए रोगी की अतिसंवेदनशीलता की पहचान करने के लिए।

निष्क्रिय रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (RPHA)। निष्क्रिय रक्तगुल्म प्रतिक्रिया सीरोलॉजिकल निदान का एक संवेदनशील तरीका है और इसका उपयोग प्रारंभिक और पूर्वव्यापी निदान दोनों के लिए किया जाता है, साथ ही साथ टीकाकरण की इम्युनोपोगिक स्थिति का निर्धारण करने के लिए भी किया जाता है। टुलारेमिया के रोगियों में, रोग के पहले या दूसरे सप्ताह के अंत में एंटीबॉडी का आमतौर पर पता लगाया जाता है, 1-1.5 महीने के बाद RPHA टाइटर्स अधिकतम मूल्यों (1: 100000-1: 20,000, कम अक्सर अधिक) तक पहुंच जाते हैं। जिसे वे 1: 100-1: 200 के स्तर पर कम करके लंबे समय तक संग्रहीत करते हैं।

टीकाकरण में, एंटीबॉडी का भी लगातार पता लगाया जाता है, हालांकि, निचले टाइटर्स में, टीकाकरण के बाद 1: 2000-1: 5000 1-1.5 महीने से अधिक नहीं, वे 1: 20-1: 80 के निम्न स्तर पर कई वर्षों तक बने रहते हैं।

तुलारेमिया एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम (एंटीजेनिक) का उपयोग RPHA की स्थापना के लिए प्रतिजन के रूप में किया जाता है। दवा एक औपचारिक भेड़ एरिथ्रोसाइट्स है जो टुलारेमिया एंटीजन के साथ संवेदनशील होती है, जो तरल और सूखे रूप में उपलब्ध होती है। तरल तैयारी - 10% एकाग्रता फॉर्मेलिन समाधान में एरिथ्रोसाइट्स का 10% निलंबन। सूखी lyophilized तैयारी - परिरक्षक के बिना एरिथ्रोसाइट्स के वैक्यूम-सूखे 10% निलंबन। उपयोग करने से पहले, इसे लेबल पर दिए निर्देशों के अनुसार पतला किया जाता है। पॉलीस्टायर्न प्लेटों में प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, दोनों दवाओं का उपयोग 2.5% एकाग्रता में किया जाता है, और माइक्रोवॉल्यूम में प्रतिक्रिया स्थापित करते समय - 0.5% एकाग्रता में।

आरपीजीए के मंचन की तकनीक। परीक्षण किए गए सेरा को खारा 1: 5 (1:10) से पतला किया जाता है और 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाता है। उसके बाद, भेड़ के एरिथ्रोसाइट्स के लिए विषम एंटीबॉडी को हटाने के लिए, सीरा को औपचारिक रूप से भेड़ के एरिथ्रोसाइट्स के 50% निलंबन के साथ इलाज किया जाता है। इसके लिए एरिथ्रोसाइट्स को 2 बूंद (0.05 मिली प्रत्येक) प्रति 1 मिली सीरम की दर से मिलाया जाता है और अच्छी तरह मिलाते हुए मिलाया जाता है। सीरम को तब तक छोड़ दिया जाता है जब तक कि एरिथ्रोसाइट्स पूरी तरह से व्यवस्थित नहीं हो जाते हैं, या कमरे के तापमान पर एक घंटे के बाद सेंट्रीफ्यूज हो जाते हैं, जिसके बाद यह शोध के लिए तैयार होता है।

एक पॉलीस्टायर्न प्लेट के कुओं की एक पंक्ति में 0.5 मिलीलीटर की मात्रा में पतला तरल डाला जाता है। सीरा के प्रारंभिक अध्ययन में, प्लेट की एक छोटी पंक्ति (6-कुओं) में प्रतिक्रिया सेट करके उनका परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। यदि एक छोटी पंक्ति में एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है, तो सीरा को एक लंबी कमजोर पड़ने वाली पंक्ति (12 कुओं) में दोबारा जांचा जाता है। पतला करने वाले तरल को फैलाने के बाद, प्रत्येक पंक्ति के पहले कुएं (छोटी या लंबी) में 1: 5 के कमजोर पड़ने पर परीक्षण किए गए सीरा के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। फिर, सीरम की समान मात्रा में, दो गुना तनुकरण के साथ अनुमापन करें। इस प्रकार, लघु श्रृंखला में 1:10 से 1: 320 तक और लंबी श्रृंखला में 1:10 से 1: 20480 तक सीरम पतलापन प्राप्त किया जाता है। सीरा के अनुमापन के बाद, प्रत्येक कुएं में संवेदीकृत एरिथ्रोसाइट्स के 2.5% निलंबन की एक बूंद (0.05 मिली) डाली जाती है। सजातीय निलंबन प्राप्त होने तक प्लेटों की सामग्री को अच्छी तरह से हिलाया जाता है। प्लेटों को एक स्थिर टेबल सतह पर कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है। प्रतिक्रिया का प्रारंभिक पंजीकरण 2-3 घंटों के बाद किया जाता है, कुओं में एरिथ्रोसाइट्स के पूर्ण अवसादन के बाद अनुमापांक का अंतिम निर्धारण किया जाता है। प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित नियंत्रण प्रदान किए जाते हैं: 1) 0.5 मिलीलीटर की मात्रा में 1:10 के कमजोर पड़ने पर परीक्षण सीरम + गैर-संवेदी एरिथ्रोसाइट्स के 2.5% निलंबन की 1 बूंद; 2) गैर-संवेदी एरिथ्रोसाइट्स के 2.5% निलंबन की 0.5 मिलीलीटर + 1 बूंद की मात्रा में तरल पतला करना; 3) संवेदनशील एरिथ्रोसाइट्स के 0.5 मिलीलीटर + 2.5% निलंबन की 1 बूंद की मात्रा में तरल को पतला करना। सभी नियंत्रण स्पष्ट रूप से नकारात्मक होने चाहिए।

आरपीजीए का लेखांकन और मूल्यांकन। प्रतिक्रिया का मूल्यांकन निम्नलिखित योजना के अनुसार किया जाता है:

1) एक तीव्र सकारात्मक प्रतिक्रिया (++++) - एरिथ्रोसाइट्स एक "छाता" के रूप में एक समान परत में छेद के नीचे गिरते हैं, जिसमें अक्सर स्कैलप्ड किनारे होते हैं;

2) सकारात्मक प्रतिक्रिया (+++) - लाल रक्त कोशिकाएं कुएं के तल के कम से कम 2/3 भाग को कवर करती हैं;

3) एक कमजोर सकारात्मक प्रतिक्रिया (++) - एग्लूटीनेट छोटा है और छेद के बहुत केंद्र में स्थित है;

4) एक संदिग्ध प्रतिक्रिया (+) - छेद के बहुत केंद्र में एरिथ्रोसाइट तलछट के आसपास एग्लूटीनेट के अलग-अलग दाने होते हैं;

5) नकारात्मक (-) - छेद के तल पर, एरिथ्रोसाइट्स एक "बटन" या चिकनी, तेज परिभाषित किनारों के साथ एक छोटी सी अंगूठी के रूप में व्यवस्थित होते हैं।

सीरम टिटर को सीरम के अंतिम कमजोर पड़ने के अनुसार ध्यान में रखा जाता है, जिसने काफी स्पष्ट प्रतिक्रिया दी (कम से कम तीन प्लस)। 1: 100 और उच्चतर के कमजोर पड़ने को डायग्नोस्टिक टिटर माना जाता है, हालांकि, आरए के मामले में, इसकी वृद्धि की निगरानी करना आवश्यक है।

तुलारेमिया में RPHA काफी विशिष्ट है और केवल ब्रुसेलोसिस सेरा के साथ कुछ क्रॉस-रिएक्शन दिखाता है। RPHA में टाइटर्स की ऊंचाई से विभेदक निदान संभव है, जो एक समरूप प्रतिजन के साथ काफी अधिक हैं।

माइक्रोवॉल्यूम में आरपीजीए स्थापित करने की तकनीक। RPHA को ताकाची-प्रकार के माइक्रोटाइटर (या माइक्रोपिपेट्स के साथ गोल-नीचे माइक्रोटाइटर प्लेट्स) का उपयोग करके माइक्रोवॉल्यूम में किया जा सकता है, जो 25 μl और 50 μl की मात्रा में सामग्री के अनुमापन की अनुमति देता है। प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने की तकनीक, सभी कार्यों का क्रम पॉलीस्टाइनिन प्लेटों में अध्ययन के समान ही है। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि माइक्रोमेथोड की संवेदनशीलता आमतौर पर मैक्रोमेथोड की तुलना में एक कमजोर पड़ने (यानी, 2 गुना) कम होती है।

एक माइक्रोटिटर में प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, ड्रॉपर पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में 50 μl की मात्रा में एक पतला तरल पेश किया जाता है। फिर, 50 μl सिर के साथ टाइट्रेटर्स का उपयोग करके, सिर को उसमें डुबो कर परीक्षण सीरम लिया जाता है। सुनिश्चित करें कि तरल ने अनुमापांक सिर को भर दिया है। सीरम के साथ टिट्रेटर को पहले कुएं में स्थानांतरित करें और इसे एक ईमानदार स्थिति में रखते हुए, दोनों दिशाओं में कई घूर्णी गति करें। फिर अनुमापांक को अगले कुएं में स्थानांतरित कर दिया जाता है और हेरफेर दोहराया जाता है। अनुमापन एक साथ कई पंक्तियों में किया जा सकता है। पूरी पंक्ति को अनुमापन करने के बाद, टिट्रेटर को आसुत जल (2 भागों के परिवर्तन के साथ) से रोटरी आंदोलनों द्वारा धोया जाता है, सिर से पानी को एक स्वाब से हटा दिया जाता है और बर्नर की लौ पर जला दिया जाता है।

अनुमापन के बाद, कुओं में एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम के 25 μl जोड़ें। माइक्रोवॉल्यूम में आरपीएचए के लिए डायग्नोस्टिकम की एकाग्रता 0.5% होनी चाहिए (यानी एरिथ्रोसाइट्स का 2.5% निलंबन अतिरिक्त रूप से 5 बार पतला होता है)। एरिथ्रोसाइट्स जोड़ने के बाद, एक सजातीय निलंबन प्राप्त होने तक प्लेटों को धीरे से हिलाया जाना चाहिए। परिणाम 1-1.5 घंटे के भीतर दर्ज किए जा सकते हैं, जो एक माइक्रोटिटर में RPHA का एक महत्वपूर्ण लाभ है। इसके अलावा, इस तकनीक के लिए सभी प्रतिक्रिया सामग्री और टेस्ट सीरा की एक छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है।

निम्नलिखित योजना के अनुसार प्रतिक्रिया को ध्यान में रखा जाता है:

1) "+" - पूर्ण रक्तगुल्म, जिसमें एरिथ्रोसाइट्स एक समान परत में छेद के नीचे तक "छाता" के रूप में नीचे के कम से कम 2/3 पर कब्जा कर लेते हैं;

2) "+ -" - आंशिक रक्तगुल्म, जिसमें एरिथ्रोसाइट्स छोटे आकार की ढीली रिंग के रूप में नीचे की ओर गिरते हैं;

3) "-" - रक्तगुल्म की अनुपस्थिति, जब एरिथ्रोसाइट्स एक छोटे बटन या एक समान किनारे के साथ एक रिंगलेट के रूप में नीचे की ओर गिरते हैं।

RPHA में प्राप्त सकारात्मक परिणाम की विशिष्टता को तीन-घटक प्रतिक्रिया - निष्क्रिय रक्तगुल्म निषेध प्रतिक्रिया (RPHA) का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है।

आरटीपीजीए के मंचन की तकनीक। इस प्रतिक्रिया का उपयोग सकारात्मक RPHA परिणाम की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए किया जाता है जब यह संदिग्ध या विशेष महामारी विज्ञान के हित में होता है। प्रतिक्रिया तंत्र में रक्तगुल्म का एक विशिष्ट निषेध होता है जब परीक्षण सीरम में मारे गए टुलारेमिया बैक्टीरिया का निलंबन जोड़ा जाता है। प्रतिक्रिया में तीन घटक परस्पर क्रिया करते हैं: परीक्षण किए गए सीरम, विशिष्ट टुलारेमिया एंटीजन और एंटीजेनिक एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम RTPHA को आमतौर पर 7-8 कुओं की एक पंक्ति में रखा जाता है। RTPHA के समानांतर एक बार-बार RPGA स्थापित करना उचित है। पतला तरल के 0.25 मिलीलीटर कुओं की दो पंक्तियों में डाला जाता है, फिर 0.25 मिलीलीटर की मात्रा में परीक्षण सीरम को दोनों पंक्तियों के पहले कुओं में जोड़ा जाता है और शीर्षक दिया जाता है। सीरम कमजोर पड़ने की दो समान श्रृंखला प्राप्त होती है। दूसरी पंक्ति के सभी कुओं में 0.25 मिलीलीटर पतला तरल और पहली पंक्ति के कुओं में 0.25 मिलीलीटर टुलारेमिया बैक्टीरिया निलंबन जोड़ें। तुलारेमिया डायग्नोस्टिकम का उपयोग किया जाता है (1 मिली में 25 बिलियन टुलारेमिया बैक्टीरिया युक्त), पहले 50 बार पतला। इस सस्पेंशन में 1 मिली में 500 मिलियन बैक्टीरिया या 0.25 मिली की मात्रा में 125 मिलियन होते हैं। एंटीजन जोड़ने के बाद, प्लेट को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए छोड़ दिया जाता है, जिसके बाद एरिथ्रोसाइट डायग्नोस्टिकम की एक बूंद (0.05 मिली) दोनों पंक्तियों के सभी कुओं में डाली जाती है, प्लेट को हिलाया जाता है और एक सपाट टेबल सतह पर छोड़ दिया जाता है। लेखांकन 2-3 घंटे में किया जाता है।

आरटीपीजीए का लेखांकन और मूल्यांकन। यदि परीक्षण सीरम में विशिष्ट टुलारेमिया एंटीबॉडी होते हैं, तो वे अतिरिक्त एंटीजन द्वारा निष्प्रभावी हो जाते हैं और कुओं की पहली पंक्ति में रक्तगुल्म नहीं होगा, या, एक उच्च सीरम अनुमापांक के साथ, हेमग्लगुटिनेशन एक छोटे (2-4 द्वारा) संख्या में नोट किया जाएगा। RPHA के साथ पंक्ति की तुलना में कुओं की। इस मामले में, परिणामों की विशिष्टता की पुष्टि की जाती है। यदि रक्तगुल्म दोनों पंक्तियों में नोट किया जाता है, अर्थात। RTPHA और RPHA के परिणाम मेल खाते हैं, यह परीक्षण किए गए सीरम में टुलारेमिया एंटीबॉडी की अनुपस्थिति को इंगित करता है। इस मामले में, RPHA के प्राथमिक परिणाम को गैर-विशिष्ट के रूप में मान्यता दी जाती है।

माइक्रोवॉल्यूम में आरटीपीजीए स्थापित करने की तकनीक। RTPHA, साथ ही RPHA, एक ताकाची-प्रकार के माइक्रोटिटर का उपयोग करके माइक्रोवॉल्यूम में किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, प्रत्येक 7-8 कुओं की दो पंक्तियों में माइक्रोप्लेट्स के कुओं में एक पतला तरल के 0.25 μl पेश किया जाता है। फिर, एक अनुमापांक का उपयोग करके, परीक्षण सीरम का 0.25 μl स्कोर किया जाता है और दोनों पंक्तियों में शीर्षक दिया जाता है। उसके बाद, पहली पंक्ति में प्रत्येक कुएं में टुलारेमिया एंटीजन के 25 μl (1 मिलीलीटर में 500 मिलियन टुलारेमिया बैक्टीरिया की एकाग्रता) को जोड़ा जाता है, और दूसरी पंक्ति में 25 μl पतला तरल जोड़ा जाता है। प्लेटों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए छोड़ दिया जाता है, जिसके बाद दोनों पंक्तियों के सभी कुओं में एंटीजेनिक स्पेक्ट्रोसाइट डायग्नोस्टिकम (0.5% एकाग्रता) के 25 μl जोड़े जाते हैं। परिणामों को ध्यान में रखा जाता है और मैक्रो-वॉल्यूम में प्रतिक्रिया के समान मूल्यांकन किया जाता है।