Непрямая риф. Серологические реакции с использованием метки

Дата: 03.03.2020

В настоящее время широко применяются серологические реакции, в которых участвуют меченые АГ-ы или АТ-ла. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы.

Они применяются:

1)для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъю-гированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями) антигенов;

2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченых диагностических антител (экспресс-диагностика).

Готовят сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ-м, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.

Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.

Нет сходных материалов

В качестве метки используются светящиеся флюорохромные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).

Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:

1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);

2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;

3) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.

Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию - свечение.

Компоненты непрямой РИФ:

1) исследуемый материал;

2) специфическая антисыворотка;

3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;

4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем - меченой антиглобулиновой сывороткой.

Светящиеся комплексы АГ-АТ - меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.

Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ - меченые - АТ-комплемент.

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом (рис. 7). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод.

Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап - в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.

Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В, у больных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1-2 сут при температуре 40 ° С, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом 125 J) и продолжают инкубацию еще 24 часа. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 8). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, последние не вступают в связь с меченным антигеном и, поэтому, он не обнаруживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и известного количества меченного антигена с активными центрами антител.В качестве метки используются радиоактивные изотопы.

В зависимости от техники постановки выделяют два способа РИА.

1) Техника «жидкая фаза» (классический РИА). Недостаток этой техники постановки - необходимость

специального разделения свободного и связанного меченого антигенов (или антител).

2) Техника «твёрдая фаза».

АГ или АТ известной специфичности связываются на сорбентах (твёрдой фазе) - стенках полистироловой лунки или пластиковой пробирки. На иммобилизованный АГ (АТ) последо-ватепьно сорбируются остальные компоненты ИК.

В зависимости от характера реакции различают следующие методы:

1) Конкурентный метод - метод, основанный на конкуренции АГ.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ (исследуемый материал - кровь, мокрота и др.);

б) идентичный к исследуемому АГ-у антиген, меченый радиоизотопом;

в) специфические АТ-ла известной концентрации, связанные на сорбенте;

г) стандартный АГ (контрольный);

д) буферный раствор.

Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ. Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ, Чем больше содержание исследуемого АГ, тем меньше меченого АГ связывается с АТ-м на поверхности сорбента. Концентрацию меченого АГ определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ в исследуемой пробе.

2) Неконкурентный метод.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ;

б) специфический АТ-а известной концентрации, связан-

ные на сорбенте;

в) идентичные к связанному антителу антитела, меченые

радиоизотопом;

г) стандартный АГ;

д) буферный раствор.

К связанным АТ добавляют исследуемый АГ. В процессе инкубации на сорбенте образуются комплексы АГ-АТ. Сорбент отмывают от свободных компонентов и добавляют меченые АТ, которые связываются со свободными валентностями АГ-на в составе комплекса. Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.

3) «Сэндвич-метод» (непрямой метод) - наиболее распространённый метод.

Компоненты:

а) исследуемая сыворотка (или исследуемый АГ);

б) АГ-ы, связанные на сорбенте (или АТ-ла, связанные на сорбенте при определении АГ-а);

в) диагностические АТ против иммуноглобулинов, меченые радиоизотопами;

г) контрольные сыворотки (или АГ-ы);

д) буферные растворы.

Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твердофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ-АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).

Достоинства РИА:

1) высокая специфичность и чувствительность;

2) простота техники постановки;

3) точность количественной оценки результатов;

4) легко поддаётся автоматизации.

Недостаток: использование радиоактивных изотопов.

Нет сходных материалов(

Иммуноферментный метод (ИФА)

Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, b - галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (рис. 9).

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем - смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидаза является раствор ортофенилдиамина.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. Сущность ИФА аналогична РИА.

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.

К преимуществам ИФА следует отнести:

Отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

Простота методов оценки реакции;

Стабильность конъюгатов;

Легко поддаётся автоматизации.

Однако, по сравнению с РИА, отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

Конкурентный тип.

Назначение.

Предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВз Ад) в сыворотках и плазме крови при диагностике вирусного гепатита В и определения носительства НВ5 Ад.

Компоненты:

1) исследуемый материал сыворотка или плазма крови;

2) антитела к НВз Ад, адсорбированные на поверхности лунки полистиролового микропланшета;

3) коньюгат - мышиные моноклониальные антитела к НВз Ад, меченые пероксидазой,

4) ортофенилендиамин (ОФД) -субстрат;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

Положительная (сыворотка с НВе Ад);

Отрицательная (сыворотка без НВз Ад). Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2) Инкубация 1 час при 37 «С.

3) Отмывание лунок.

4) Внесение конъюгата.

5) Инкубация 1 час при 37 «С.

6) Отмывание лунок.

7) Внесение ОФД. При наличии НВз Ад раствор а лунках желтеет.

Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых НВз Ад.

Механизм

Реакция протекает в три фазы:

1) НВз Ад исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (НВз Ад - агл\ НВз АТ).

2) Антитела НВз Ад, меченые пероксидазой, связываются с оставшимися свободными детерминантами НВз Ад комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ {ап!1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, меченые пероксидазой).

3) ОФД взаимодействуют (с пероксидазой) комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

Непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.

Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции - обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:

1) исследуемый материал - сыворотка крови;

2) синтетические

При данном методе используют явление люминесценции.

Сущность явления люминесценции заключается в том, что при поглощении различных видов энергии (световой, электрической и др.) молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.

В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции - это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.

Многие вещества и живые микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (так называемой первичной), однако интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и используемые для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы. Такая наведенная флуоресценция называется вторичной.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300-460 нм). Для этих целей в лабораториях имеются люминесцентные микроскопы различных моделей - МЛ-1-МЛ-4, «Люмам».

В вирусологической практике применяют два основных метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител (или РИФ).

Флуорохромирование - это обработка препаратов флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения их. Наибольший интерес представляет флуорохром акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует зеленым цветом, а рибонуклеиновая - рубиново-красным.

Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.

Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:

готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах - инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;
препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4-16 ч);
окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.

Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного - контроль.

Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.

Прямой метод (одноступенчатый) . На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.

Непрямой метод (двухступенчатый) . На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного - продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую антикроличью сыворотку.

Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов, так как он основан на использовании антивидовых сывороток. Чаще применяют антикроличьи, антибычьи, антилошадиные сыворотки и сыворотки против глобулинов морской свинки.

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген - антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

4. В воздухе детской спальни яслей обнаружено 75 мт/м3 стрептококка, 12 мт/м3 стафилококка и 1 мт/м3 туберкулезных бактерий. Дать санитарно-бактериологическую оценку воздуха и наметить план его санации.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № _54

Ретровирусы. ВИЧ-инфекция (СПИД), и ее возбудители.

Вирус иммунодефицита человека вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчивающуюся развитием синдрома приобретенного иммунного дефицита.

Возбудитель ВИЧ-инфекции - лимфотропный вирус, относящийся к семейству Retroviridae роду Lentivirus.

Морфологические свойства: РНК-содержащий вирус. Вирусная частица сферической формы Оболочка состоит из двойного слоя липидов, пронизанного гликопротеинами. Липидная оболочка происходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула состоит из 2 субъединиц, находящихся на поверхности вириона и пронизывающих его липидную оболочку.

Сердцевина вируса конусовидной формы, состоит из капсидных белков, ряда матриксных белков и белков протеазы. Геном образует две нити РНК, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.

Геном вируса состоит из 3 основных структурных генов и 7 регуляторных и функциональных генов. Функциональные гены выполняют регуляторные функции и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе.

Вирус поражает в основном Т- и В-лимфоциты, некоторые клетки моноцитарного ряда (макрофаги, лейкоциты), клетки нервной системы.

Культуральные свойства: на культуре клеток Т-лимфоцитов и моноцитов человека (в присутствии ИЛ-2).

Антигенная структура: 2 типа вируса - ВИЧ-1 и ВИЧ-2 ВИЧ-1, имеет более 10 генотипов (субтипов): А, В, С, D, E, F…, отличающихся между собой по аминокислотному составу белков.

ВИЧ-1 делят на 3 группы: М, N, О. Большинство изолятов относится к группе М, в которой выделяют 10 подтипов: А, В, С, D, F-l, F-2, G, Н, I, К. Устойчивость: Чувствителен к физическим и химическим факторам, гибнет в при нагревании. Вирус может длительно сохраняться в высушенном состоянии, в высохшей крови.

Факторы патогенности, патогенез: Вирус прикрепляется к лимфоциту, проникает в клетку и репродуцирует в лимфоците. В результате размножения ВИЧ в лимфоците последние разрушаются или теряют свои функциональные свойства. В результате размножения вируса в различных клетках происходит накопление его в органах и тканях, и он обнаруживается в крови, лимфе, слюне, моче, поте, каловых массах.

При ВИЧ-инфекции снижается число Т-4-лимфоцитов, нарушается функция В-лимфоцитов, подавляется функция естественных киллеров и ответ на антигены снижается и нарушается продукция комплемента, лимфокинов и других факторов, регулирующих иммунные функции (ИЛ), в результате чего наступает дисфункция иммунной системы.

Клиника: поражается дыхательная система (пневмония, бронхиты); ЦНС (абсцессы, менингиты); ЖКТ (диареи), возникают злокачественные новообразования (опухоли внутренних органов).

ВИЧ-инфекция протекает в несколько стадий: 1) инкубационный период, составляющий в среднем 2-4 недели; 2) стадия первичных проявлений, характеризующаяся вначале острой лихорадкой, диареей; завершается стадия бессимптомной фазой и персистенцией вируса, восстановлением самочувствия, однако в крови определяются ВИЧ-антитела, 3) стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной системы. Завешается ВИЧ-инфекция последней, 4-й терминальной стадией- СПИДом.

Микробиологическая диагностика.

Вирусологические и серологические исследования включают методы определения антигенов и антител ВИЧ. Для этого используют ИФА, ИБ и ПЦР. Сыворотки больных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 содержат антитела ко всем вирусным белкам. Однако для подтверждения диагноза определяют антитела к белкам gp41, gpl20, gpl60, p24 у ВИЧ-1 и антитела к белкам gp36, gpl05, gpl40 у ВИЧ-2. ВИЧ-антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ.

Метод выявления вируса в крови, лимфоцитах. Однако при любой положительной пробе для подтверждения результатов ставится реакция ИБ. Применяют также ПЦР, способную выявлять ВИЧ-инфекцию в инкубационном и раннем клиническом периоде, однако ее чувствительность несколько ниже, чем у ИФА.

Клинический и серологический диагнозы подтверждаются иммунологическими исследованиями, если они указывают на наличие иммунодефицита у обследуемого пациента.

Диагностическая иммуноферментная тест-система для определения антител к ВИЧ – включает вирусный АГ, адсорбированный на носителе, АТ против Ig человека. Используется для серодиагностики СПИДа.

Лечение: применение ингибиторов обратной транскриптазы, действующих в активированных клетках. Препараты являются производные тимидина - азидотимидин и фосфазид.

Профилактика. Специфическая - нет.

Влияние физических и химических факторов на микробы. Мутация и ее значение для практической медицины. Примеры. Значение экологии.

Действие химических и биологических факторов.

Действие химических веществ

Химические вещества могут тормозить или полностью подавлять рост микроорганизмов. Если химическое вещество подавляет рост бактерий, но после удаления их рост вновь возобновляется.

Противомикробные вещества с учетом химического строения и механизма их бактерицидного действия на бактерии можно подразделить на следующие группы: окислители, галогены, соединения металлов, кислоты и щелочи, поверхностно-активные вещества, спирты, красители, производные фенола и формальдегида.

Окислители. К этой группе относятся перекись водорода и калия перманганат.

Галогены. Хлор, йод и их препараты: хлорная известь, хлорамин Б, пантоцид, раствор йода спиртовый 5%-ный, йодинол, йодоформ.

Соединения тяжелых металлов (соли свинца, меди, цинка, серебра, ртути; металлорганические соединения серебра: протаргол, колларгол). Эти соединения способны оказывать как противомикробное, так и разнохарактерное местное действие на ткани макроорганизма.

Кислоты и щелочи. В основе бактерицидного действия кислот и щелочей лежат дегидратация микроорганизмов, изменение рН питательной среды, гидролиз коллоидных систем и образование кислотных или щелочных альбуминатов.

Красители обладают свойствами задерживать рост бактерий. Они действуют медленно, но более избирательно.

Формальдегид-бесцветный газ. В практике применяют 40%-ный водный раствор формальдегида (формалин). Газообразный и растворенный в воде формальдегид губительно влияет на вегетативные и споровые формы бактерий.

Действие биологических факторов

Действие биологических факторов проявляется прежде всего в антагонизме микробов, когда продукты жизнедеятельности одних микробов обусловливают гибель других.

Антибиотики (от греч. anti - против, bios - жизнь) - биологически активные вещества, образуемые в процессе жизнедеятельности грибов, бактерий, животных, растений и созданные синтетическим путем, способные избирательно подавлять и убивать микроорганизмы, грибы, риккетсии, крупные вирусы, простейшие и отдельные гельминты.

3. Реакция биологической активности бактериальных ферментов при ревматизме, диагностическое и практическое значение, защитная роль антител против ферментов в приобретенном иммунитете (определение антигиалуронидазы и анти О-стрептолизина).

Ревматизм - общее заболевание инфекционно-аллергического характера, при котором поражается соединительная ткань, главным образом сердечно-сосудистой системы, а также суставы, внутренние органы, центральная нервная система. Считается, что причиной развития ревматизма является активация патогенных микроорганизмов, главным образом бета-гемолитического стрептококка группы А. Именно ему отводится главная роль в этиологии и патогенезе ревматической болезни. Во-первых, заболевание развивается на фоне стрептококковой инфекции. Во-вторых, в крови больных обнаруживается большое количество антител к микроорганизмам этой группы. В-третьих, профилактика заболевания успешно проводится антибактериальными препаратами.

При ревматоидном артрите синовиальные мембраны, по невыясненным причинам, секретируют большое количество фермента глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы которая также разрушает дисульфидные связи в клеточной мембране. При этом наблюдается «утечка» протеолитических ферментов из клеточных лизосом, которые вызывают повреждения близлежащих костей и хрящей. Организм отвечает на это путём выработки цитокинов, среди которых также есть фактор некроза опухоли α TNF-α. Каскады реакций в клетках, которые запускаются цитокинами, ещё больше усугубляют симптомы болезни. Хроническое ревматоидное воспаление, ассоциированное с TNF-α, очень часто вызывает повреждения хрящей и суставов, ведущие к физической нетрудоспособности.

61. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение. Прямой и непрямой методы постановки.

Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.тБактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию - свечение.

Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Светящиеся комплексы АГ-АТ - меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Оглавление:

Прямые способы

Микроскопия в темном поле

Бледные трепонемы не могут расти на питательных средах и не визуализируются под световым микроскопом. Так как обнаружение патогена с помощью обычной микроскопии невозможно, применяют специальный микроскоп с темным полем, где возбудитель виден в виде спирали на темном фоне.

Для проведения микроскопии забирается биоматериал с подозрительного на заболевание очага. Микроскопия в темном поле – это возможный способ оценки кожных поражений, таких как шанкр первичного сифилиса или кондилома вторичного сифилиса. Если материал макулопапулезного очага сухой, исследуют аспират лимфатического узла.

Отрицательный результат не исключает патологический процесс, статистически выявление возбудителя возможно только в 80%.

ПЦР-диагностика

Реакция, направленная на многократное увеличение ДНК бледной трепонемы, позволяет сделать вывод об инфицировании сифилисом или об его отсутствии.

Биоматериал для анализа может быть любым: кровь, содержимое сифилида, спинномозговой жидкости и пр. Тест подходит для инкубационного периода.

ПЦР полностью специфична.

Непрямые серологические анализы на сифилис: трепонемные и нетрепонемные тесты

Серологические анализы (КСР или комплекс серологических реакций) считаются наиболее распространенным способом для диагностики всех стадий сифилиса. Выделяют следующие реакции:

агглютинации;
преципитации;
иммунофлюоресценции;
иммуноферментный анализ и пр.

Также серологические анализы на сифилис подразделяют на трепонемные и нетрепонемные.

Нетрепонемные

При подозрении на приобретенный сифилис выполняют скрининговое тестирование, для чего используют нетрепонемные тесты , определяющие антитела к липоидным антигенам тканей хозяина или возбудителя в разнообразных модификациях. В РФ рутинно выполняют реакцию микропреципитации (РМП), которая позволяет выявить антитела к поврежденным патогеном клеткам в крови. Достоверность скрининга высокая, но специфичность невелика, поэтому тестирование подходит для первичного массового обследования в превентивных целях.

Чувствительность экспресс-тестов оценивается в 78-86% для выявления первичного сифилиса, 100% для вторичного сифилиса и 95-98% для выявления третичного сифилиса.

Специфичность - от 85-99%, иногда- менее, что встречается при следующих состояниях:

гестация;
менструация;
онкология;
заболевания соединительной ткани;
вирусные заболевания;
болезни печени;
вакцинация;
«свежий» ИМ;
сыпной тиф и пр.

Помимо этого, избыток жиров в рационе, употребление спиртосодержащих напитков и прием некоторых лекарств могут привести к ложноложительным заключениям.

Результаты скринингового тестирования становятся положительными через 1-2 недели после образования шанкра. Нетрепонемные тесты дают отрицательный ответ через некоторое время после лечения. При ВИЧ-статусе нетрепонемные антитела могут выявляться длительно, иногда на протяжении всей жизни (что подтверждается результатами соответствующего рандомизированнного исследования).

Другие разновидности нетрепонемных анализов: VDRL, плазмореагиновый тест (RPR) , проба с толуидиновым красным, реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк).

Реакция Вассермана (RW)

Связывание комплемента – ответ иммунной системы на инфицирование, результат варьируется от отрицательного (ставится «-»), до резко положительного «++++» или 4 плюса.

В начальной стадии первичного сифилиса RW отрицательна.

Трепонемные

Из-за возможности ложноположительных результатов для подтверждения любого положительного или сомнительного результата нетрепонемного анализа, используют трепонемные тесты:

реакция иммунофлюоресценции (РИФ);
гемагглютинация (РПГА),
иммуноферментный анализ (ИФА) для иммуноглобулинов класса G (IgG) и иммуноглобулина М (IgM);
иммуноблоттинг;
РИБТ/РИТ (реакция иммобилизации бледных трепонем).

Трепонемные тесты не используются для оценки эффективности терапии.

РИФ на определение трепонемных АТ класса IgG применяют после положительного результата экспресс-анализов (чувствительность 84% для первичного сифилиса и 100 % при других стадиях, специфичность 96%). Для диагностики у новорожденных не применимы.

В некоторых лабораториях используют «обратные» скрининговые исследования.

CDC (Centers for Disease Control and Prevention, США) рекомендует традиционные исследования, с проверкой количественными нетрепонемными тестами, при положительном результате проводится лечение.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

На собранный материал наносят сыворотку с мечеными флюорохромом антителами, специфичными к антигену бледной трепонемы, возбудитель притягивает к себе иммунные комплексы, из-за чего начинает светиться в люминесцентном микроскопе.

Реакция пассивной гемоагглютинации или РПГА

До появления гемагглютинации (склеивания) эритроцитов с момента внедрения бледной трепонемы должно пройти не менее 4 недель.

Подготовленные эритроциты с фиксированными белковыми фракциями патогена взаимодействуют с плазмой, если есть антитела к сифилису, происходит реакция.

Подходит для подтверждения любой стадии заболевания.

Иммуноферментный анализ

В основу положена реакция антиген-антитело. Выявляются антитела различных классов, которые можно оценить количественно.

Полученные результаты позволяют судить о длительности патологического процесса, успешности проводимого лечения, иммунологическом статусе, активности возбудителей.

Иммуноблоттинг – разновидность ИФА, применяют для углубленной диагностики при всех сомнительных результатах.

Чувствительность и специфичность близка к 100%, на сегодняшний день ультрачувствительный метод идентификации белков.

РИБТ

Способ основан на реакции антиген-антитело. Антигеном служат бледные трепонемы, культивируемые в тестикулах кролика. При взаимодействии с антителами зараженного человека, патогены утрачивают подвижность. Реакция оценивается с помощью микроскопии в темном поле.

Обратите внимание

РИБТ в настоящее время применяют из-за трудоемкости реже, но анализ может быть полезен для решения спорных вопросов (ложноположительные реакции на сифилис).

Дифференциальная диагностика

Наибольшую сложность представляет диагностика третичного сифилиса, что обуславливается симптомами со стороны сердечно-сосудистой и нервной системы, а также проявлениями со стороны кожного покрова.

Пациенты обязательно должны быть обследованы на , и .

Перечислим заболевания, с которыми проводят дифференциальную диагностику при сифилисе:

дерматологические проявления ;
генитальные бородавки ();
донованоз;
венерическая лимфогранулема;
вирус ;
фрамбезия.

С чего начинается диагностика сифилиса

Изначально проводится беседа с пациентом, во время которой уточняются детали: когда был подозрительный половой контакт и какие есть жалобы.

После сбора анамнеза переходят к физикальному осмотру, особое внимание уделяется области гениталий и ануса, слизистым оболочкам и лимфатическим узлам. Предварительный диагноз уже может быть установлен. Окончательная верификация происходит с помощью лабораторных анализов.

Если сказать просто о сложном, то одни анализы выявляют возбудителя сифилиса, а другие отражают реакцию организма на внедрение бледной трепонемы.

Для установки окончательного диагноза РПГА следует дополнить 1 трепонемным и 1 нетрепонемным анализом.

Диагностика сифилиса у беременных

Проводятся обязательное исследование на сифилис несколько раз в течение беременности.

Направление на анализ КСР выдается во время первого визита женщины в консультацию, и за время беременности трижды выполняется обследование. Пациентки из высокой группы риска с отягощенным анамнезом: , асоциальные, зависимые и пр. требуют особенно пристального внимания.

Если результаты анализа положительные, проводят более глубокую диагностику, и по показаниям назначают лечение, которое зависит от стадии и клинических проявлений.

Диагностика врожденного сифилиса

Большинство детей с рождаются у нелеченных матерей, либо получивших терапию слишком поздно.

Трепонемные тесты с использованием неонатальной сыворотки не рекомендуются из-за пассивного переноса антител IgG. Все дети, рожденные от матерей с сифилисом, должны обследоваться с помощью количественного нетрепонемного серологического теста (RPR или VDRL), выполненного с использованием сыворотки крови новорожденного.

Как трактовать результаты серологических исследований

Реакция микропреципитации, РИФ и РПГА отрицательны – норма, положительны – подтверждение сифилиса.

Реакция микропреципитации отрицательна, остальные положительны – сифилис в анамнезе после проведения специфической терапии, либо поздняя стадия.

Отрицательная РИФ при положительных РПГА и реакции микропреципитации – результат вызывает сомнения, повторная комплексная оценка.

Отрицательный результат РИФ и микропреципитации, но положительная РПГА – состояние после успешной антибиотикотерапии либо ложноположительный результат.

Положительная РИФ при отрицательных РПГА и реакции микропреципитации – ранняя стадия, проведенное лечение или недостоверность результата.

Положительная реакция микропреципитации, не подтвержденная ни РПГА, ни РИФ – отсутствие сифилиса.

Инструментальное исследование при сифилисе

Инструментальная диагностика проводится в зависимости от вовлеченности органов. Например, гранулематозное поражение печени можно увидеть при брюшной полости.

У пациентов с третичным сифилисом может показать дилатацию аорты. Линейная кальцификация по ходу аорты свидетельствует в пользу сифилитического аортита.