Kas ir aglutinācijas reakcijas darbības pamatā. Paātrinātās aglutinācijas reakciju varianti

Šajās reakcijās piedalās antigēni daļiņu veidā (mikrobu šūnas, eritrocīti un citi korpuskulārie antigēni), kas ar antivielu palīdzību tiek salīmēti kopā un izgulsnējas.

Aglutinācijas reakcijas inscenēšanai(RA) ir nepieciešami trīs komponenti: 1) antigēns (aglutinogēns);

2) antivielas (aglutinīns)

3) elektrolīts (izotonisks nātrija hlorīda šķīdums).

Indikatīvā aglutinācijas reakcija (RA)

Provizoriskais jeb slāņveida RA tiek novietots uz stikla priekšmetstikliņa istabas temperatūrā. Šim nolūkam uz stikla ar Pasteur pipeti uzpilina seruma pilienu atšķaidījumā 1:10 - 1:20 un izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma kontroles pilienu. Vienā un otrā ar bakterioloģisko cilpu ievada kolonijas vai ikdienas baktēriju kultūru (diagnostikas pilienu) un rūpīgi sajauc. Reakcijas tiek ņemtas vērā pēc dažām minūtēm vizuāli, dažreiz izmantojot palielināmo stiklu (x5). Ar pozitīvu RA pilē ar serumu tiek novērotas lielas un mazas pārslas, ar negatīvu RA serums paliek vienmērīgi duļķains.

Rīsi. 2. Pagaidu aglutinācijas reakcija.

Paplašināta aglutinācijas reakcija lai noteiktu specifisko antivielu titru pacientam.

Serodiagnostikai paredzēto paplašināto RA ievieto pacientu serumā. To arī atšķaida ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu no 1:50 līdz 1:100 līdz 1:800 vai 1:1600. Tā kā zemāki seruma titri var saturēt normālus aglutinīnus, kas atrodas veseliem cilvēkiem vai pacientiem ar atšķirīgu diagnozi (diagnostikas titru). Kā antigēns šajā reakcijā tiek izmantots diagnostikas līdzeklis - apzināti zināmas, kā likums, nogalinātu baktēriju suspensijas.

Aglutinācijas mēģenēs ielej 1 ml izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma. Pirmajam no tiem pievieno 1 ml seruma, kas atšķaidīts 1:100, un pēc sajaukšanas 1 ml pārnes uz otro, no otrā uz trešo utt. Iegūtajos divkāršos serumu atšķaidījumos (no 1:100 līdz 1:1600 un vairāk) pievieno 1-2 pilienus baktēriju suspensijas, kas satur 3 miljardus mikrobu ķermeņu 1 ml. Caurules sakrata un ievieto termostatā 37 ° C temperatūrā uz 2 stundām, pēc tam vienu dienu tur istabas temperatūrā.

Paplašinātās aglutinācijas reakcija tiek ņemta vērā, katru mēģeni secīgi izvērtējot, sākot ar kontroles, viegli kratot. Kontrolmēģenēs nedrīkst būt aglutinācijas. Aglutinācijas reakcijas intensitāte ir atzīmēta ar šādām pazīmēm: ++++ - pilnīga aglutinācija (aglutinācijas pārslas absolūti dzidrā šķidrumā); +++ - nepilnīga aglutinācija (pārslas vāji bāla šķidrumā); ++ - daļēja aglutinācija (pārslas ir skaidri atšķiramas, šķidrums ir nedaudz duļķains); + - vāja, apšaubāma aglutinācija - šķidrums ir ļoti duļķains, pārslas tajā ir slikti atšķiramas; - - nav aglutinācijas (šķidrums ir vienmērīgi duļķains).

Seruma titru uzskata par tā pēdējo atšķaidījumu, kurā aglutinācijas intensitāte ir novērtēta vismaz ar diviem plus punktiem (++).

Rīsi. 7. Paplašināta aglutinācijas reakcija.

Netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija (RNGA, RPHA)

Reakcija tiek izteikta:

1) polisaharīdu, proteīnu, baktēriju ekstraktu un citu augsti dispersu vielu, riketsiju un vīrusu noteikšanai, kuru kompleksi ar aglutinīniem nav redzami pie parastā RA,

2) noteikt antivielas pacientu serumos pret šīm augsti izkliedētajām vielām un mazākajiem mikroorganismiem.

Netiešā jeb pasīvā aglutinācija tiek saprasta kā reakcija, kurā antivielas mijiedarbojas ar antigēniem, kas iepriekš adsorbēti uz inertām daļiņām (latekss, celuloze, polistirols, bārija oksīds utt., vai aitas eritrocīti, I (0) -cilvēka asiņu grupa)

Pasīvās hemaglutinācijas (RPHA) reakcijā tiek izmantots nesējs eritrocīti... Ar antigēnu noslogotie eritrocīti salīp kopā specifisku antivielu klātbūtnē pret šo antigēnu un izgulsnējas. Antigēnu sensibilizētie eritrocīti tiek izmantoti RPHA kā eritrocītu diagnostikas līdzeklis antivielu noteikšanai (serodiagnostika). Ja eritrocītus noslogo ar antivielām (eritrocītu antivielu diagnostika), tad to var izmantot antigēnu noteikšanai.

Rīsi. 3. RPHA shēma: eritrocīti (1), piesātināti ar antigēnu (3), saistās ar specifiskām antivielām (4).

Iestudējums... Seruma sērijas atšķaidījumus sagatavo polistirola plākšņu iedobēs. Priekšpēdējā iedobē pievienojiet 0,5 ml acīmredzami pozitīva seruma un 0,5 ml fizioloģiskā šķīduma (kontroles) pēdējā iedobē. Pēc tam visām iedobēm pievieno 0,1 ml atšķaidīta eritrocītu diagnostikas šķīduma, sakrata un ievieto termostatā uz 2 stundām.

Grāmatvedība... Pozitīvā gadījumā eritrocīti nosēžas akas apakšā vienmērīga šūnu slāņa veidā ar salocītu vai robainu malu (apgriezts lietussargs), negatīvā gadījumā tie nosēžas pogas vai gredzena veidā. .

4. att. RNGA (RPGA) uzskaite.

RNGA rezultātu uzskaite, komplekts botulīna toksīna noteikšanai.

Botulisma izraisītājs - Clostridium botulinum ražo septiņu serovāru toksīnus (A, B, C, D, E, F, G), bet serovari A, B, E ir biežāk nekā citi.Visi toksīni atšķiras pēc antigēnām īpašībām un var reakcijās var atšķirties pēc tipa specifiskiem serumiem ... Šim nolūkam ir iespējams veikt pasīvu (netiešo) hemaglutinācijas reakciju ar pacienta serumu, kurā tiek pieņemts toksīna klātbūtne, un eritrocītiem, kas noslogoti ar A, B, E tipa antitoksisku antibotulīna serumu antivielām. Normāls serums kalpo kā kontrole.

Rīsi. 3. RNGA paziņojums un rezultāts.

Grāmatvedība. Pozitīvā gadījumā eritrocīti nosēžas akas apakšā vienmērīga šūnu slāņa veidā ar salocītu vai robainu malu (apgriezts lietussargs), negatīvā gadījumā tie nosēžas pogas vai gredzena veidā. .

Secinājums: pacienta serumā tika konstatēts E tipa botulīna toksīns.

Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (RTGA).

Rīsi. 8. Hemaglutinācijas (RTGA) inhibīcijas reakcija (shēma).

Reakcijas princips ir balstīts uz AT spēju saistīt dažādus vīrusus un neitralizēt tos, padarot neiespējamu eritrocītu aglutināciju. Vizuāli šis efekts izpaužas hemaglutinācijas "inhibīcijā". RTGA izmanto vīrusu infekciju diagnostikā specifisku antihemaglutinīnu noteikšanai un dažādu vīrusu identificēšanai pēc to hemaglutinīniem, kuriem piemīt Ag īpašības.

Vīrusa tipizēšana tiek veikta RTGA reakcijā ar tipam raksturīgu serumu komplektu. Reakcijas rezultāti tiek ņemti vērā, ja nav hemaglutinācijas. A tipa vīrusa apakštipus ar antigēniem H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 un citiem RTGA var diferencēt ar homologu tipam specifisku serumu komplektu.

Rīsi. 9. RTGA rezultāti gripas vīrusa tipizēšanas laikā

Leģenda: - hemaglutinācijas kavēšana (poga); - hemaglutinācija (lietussargs).

Secinājumi: Testa materiāls satur A tipa gripas vīrusu ar H3N2 antigēnu

Priekšmeta satura rādītājs "Imūnmodulatori. Infekcijas slimību imūndiagnostika.":

Paplašināta aglutinācijas reakcija (RA). Lai noteiktu AT pacienta asins serumā, ielieciet paplašināta aglutinācijas reakcija (RA)... Šim nolūkam asins seruma atšķaidījumu sērijai pievieno diagnostiku - nogalinātu mikroorganismu vai daļiņu suspensiju ar adsorbētu Ag. Maksimālā atšķaidījuma došana aglutinācija Ag sauc par seruma titru.

Aglutinācijas reakcijas šķirnes (RA) AT noteikšanai - asins pilienu tests tularēmijas noteikšanai (ar diagnozes uzlikšanu asins pilienam un redzamu bālganu aglutinātu parādīšanos) un Hedlsona reakcijas uz brucelozi (ar genciāna violetu krāsotu diagnostiku uz pilieniņa asins serums).

Indikatīvā aglutinācijas reakcija (RA)

Lai identificētu izolētos mikroorganismus, uz priekšmetstikliņiem ievietojiet aptuvenu RA. Šim nolūkam patogēna kultūru pievieno standarta diagnostikas antiseruma pilienam (atšķaidījums 1:10, 1:20). Ja rezultāts ir pozitīvs, tiek noteikta detalizēta reakcija ar pieaugošiem antiseruma atšķaidījumiem.

Reakcija uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumos, kas ir tuvu diagnostiskā seruma titram.

OAS. Somatiskais O-Ag ir termiski stabilas un var izturēt vārīšanu 2 stundas.Mijiedarbojoties ar AT, veidojas smalkgraudainus agregātus.

H-Ag. H-Ag (flagellate) ir termolabīli un ātri sadalās 100 ° C temperatūrā, kā arī etanola iedarbībā. Reakcijās ar H-antiserumu pēc 2 stundu ilgas inkubācijas veidojas irdenas lielas pārslas (veidojas baktērijām, kas salīp kopā ar flagellas).

Vi-Ar vēdertīfa baktērijas ir relatīvi termostabilas (iztur 60-62 ° C temperatūru 2 stundas); inkubējot ar Vi-antiserumu, veidojas smalkgraudains aglutināts.

Tiešas hemaglutinācijas reakcijas

Vienkāršākais no tiem reakcijas - aglutinācija eritrocīti jeb hemaglutinācija, ko izmanto asins grupu noteikšanai AB0 sistēmā. Lai noteiktu aglutinācija(vai tā trūkums), izmantojot standarta antiserumus ar anti-A un anti-B-aglutinīniem. Reakciju sauc par tiešo, jo pētāmās Ag ir dabiskas eritrocītu sastāvdaļas.

Kopīgs ar tieša hemaglutinācija mehānismiem ir vīrusu hemaglutinācija. Daudzi vīrusi spēj spontāni aglutinēt putnu un zīdītāju eritrocītus; to pievienošana eritrocītu suspensijai izraisa no tiem agregātu veidošanos.

Aglutinācijas reakcija

Aglutinācija (lat. aglutinācija- līmēšana) - antigēnu nesošo korpuskulāro daļiņu (veselu šūnu, lateksa daļiņu u.c.) salīmēšana (savienošana) ar specifisku antivielu molekulām elektrolītu klātbūtnē, kas beidzas ar pārslu vai nogulšņu (aglutināta) veidošanos, kuras ir redzamas neapbruņotu aci. Nogulumu raksturs ir atkarīgs no antigēna rakstura: flagellate baktērijas dod lielus flokulentus nogulumus, flagellate un bezkapsulu - smalkgraudainus, kapsulas - smagus. Izšķir tiešo aglutināciju, kurā baktēriju vai jebkuras citas šūnas, piemēram, eritrocītu, pašu antigēni tieši piedalās mijiedarbībā ar specifiskām antivielām; un netiešie jeb pasīvie, kuros baktēriju šūnas vai eritrocīti vai lateksa daļiņas ir ne paši savu, bet uz tiem sorbētu svešu antigēnu (vai antivielu) nesēji, lai noteiktu tām specifiskās antivielas (vai antigēnus). Aglutinācijas reakcija galvenokārt ietver antivielas, kas pieder IgG un IgM klasēm. Tas notiek divās fāzēs: pirmkārt, notiek specifiska antivielu aktīvā centra mijiedarbība ar antigēna determinantu; šis posms var notikt, ja nav elektrolītu, un to nepavada redzamas izmaiņas reaktīvajā sistēmā. Otrajam posmam - aglutināta veidošanai - ir nepieciešama elektrolītu klātbūtne, kas samazina antigēna + antivielu kompleksu elektrisko lādiņu un paātrina to adhēzijas procesu. Šī fāze beidzas ar aglutināta veidošanos.

Aglutinācijas reakcijas veic vai nu uz stikla vai gludām kartona plāksnēm, vai sterilās aglutinācijas mēģenēs. Aglutinācijas reakcijas (tiešās un pasīvās) uz stikla parasti tiek izmantotas kā paātrināta metode specifisku antivielu noteikšanai pacienta serumā (piemēram, brucelozes gadījumā) vai patogēna seroloģiskai identificēšanai. Pēdējā gadījumā parasti tiek izmantoti labi attīrīti (adsorbēti) diagnostikas serumi, kas satur tikai monoreceptoru antivielas vai to komplektu pret dažādiem antigēniem. Stikla aglutinācijas reakcijas neapšaubāmā priekšrocība ir tās formulēšanas vienkāršība un fakts, ka tas aizņem vairākas minūtes vai pat sekundes, jo abas sastāvdaļas tajā tiek izmantotas koncentrētā veidā. Tomēr tai ir tikai kvalitatīva vērtība, un tā ir mazāk jutīga nekā mēģene. Detalizēta aglutinācijas reakcija mēģenēs dod precīzākus rezultātus, jo ļauj noteikt kvantitatīvo antivielu saturu serumā (noteikt tā titru) un, ja nepieciešams, reģistrēt antivielu titra pieauguma faktu, kas ir diagnostiskā vērtība. Lai izveidotu reakciju, aglutinācijas mēģenēs ievada serumu, kas atšķaidīts ar 0,85% NaCl šķīdumu, un vienādu tilpumu (parasti 0,5 ml) standarta diagnostikas (vai testa kultūras) suspensijas, kas satur 1 miljardu baktēriju 1 ml. Aglutinācijas reakcijas rezultāti tiek ņemti vērā iepriekš pēc 2 stundu ilgas mēģenes inkubācijas 37 ° C temperatūrā un visbeidzot pēc 20 - 24 stundām pēc divām pazīmēm: nogulumu klātbūtne un izmērs un caurspīdīguma pakāpe. no supernatanta šķidruma. Vērtēšana tiek veikta četrkārtīgā sistēmā. Reakciju obligāti papildina seruma un antigēna kontrole. Gadījumos, kad patogēna seroloģiskai identificēšanai tiek ievietota detalizēta aglutinācijas reakcija mēģenē, tai ir diagnostiskā vērtība, ja reakcija novērtēta kā pozitīva, ja diagnostiskais serums ir atšķaidīts vismaz uz pusi no tā titra.

Jāņem vērā, ka, sajaucot homologu antigēnu un antivielu šķīdumus, ne vienmēr tiek novērotas redzamas aglutinācijas reakcijas izpausmes. Nogulsnes veidojas tikai ar kādu optimālu abu reakcijas komponentu attiecību. Ārpus šīm robežām, ja ir ievērojams antigēna vai antivielu pārpalikums, reakcija netiek novērota. Šo parādību sauc par "prozona fenomenu". To novēro gan aglutinācijas reakcijā, gan izgulsnēšanās reakcijā. Prozona parādīšanās imūnreakcijās ir izskaidrojama ar to, ka tajās iesaistītie antigēni, kā likums, ir polideterminanti, un IgG antivielu molekulām ir divi aktīvi centri. Ar antivielu pārpalikumu katras antigēna daļiņas virsma tiek pārklāta ar antivielu molekulām, lai nepaliktu brīvas determinantu grupas, līdz ar to otrs, nesaistītais antivielu aktīvais centrs nevar mijiedarboties ar citu antigēnu daļiņu un saistīt tās viena ar otru. Ar antigēna pārpalikumu tiek nomākta arī redzamā aglutināta jeb nogulsnes veidošanās, kad nepaliek neviena brīva aktīvā antivielu vieta un līdz ar to antigēns + antiviela + antigēns kompleksi nevar kļūt lielāki.

1.1. AGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RA)

AGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RA)

Savas specifikas, inscenēšanas vienkāršības un demonstrativitātes dēļ aglutinācijas reakcija ir kļuvusi plaši izplatīta mikrobioloģiskajā praksē daudzu infekcijas slimību diagnosticēšanai.

Aglutinācijas reakcijas pamatā ir antivielu (aglutinīnu) mijiedarbības specifika ar veselām mikrobu vai citām šūnām (aglutinogēniem). Šīs mijiedarbības rezultātā veidojas daļiņas - aglomerāti, kas izgulsnējas (aglutinējas) pārslu veidā.

Aglutinācijas reakcijā var piedalīties gan dzīvas, gan nogalinātas baktērijas, spirohetas, sēnītes, vienšūņi, riketijas, kā arī eritrocīti un citas šūnas. Reakcija notiek divās fāzēs: pirmā (neredzamā) - specifiskā, antigēna un antivielu kombinācija, otrā (redzamā) - nespecifiskā, antigēnu līmēšana, t.i. aglutināta veidošanās.

Aglutināts veidojas, kad viens aktīvais bivalentās antivielas centrs pievienojas antigēna determinantajai grupai. Aglutinācijas reakcija, tāpat kā jebkura seroloģiskā reakcija, notiek elektrolītu klātbūtnē.

Ārēji pozitīvas aglutinācijas reakcijas izpausme ir divējāda. Ziedu mikrobiem, kuriem ir tikai somatiskais O-antigēns, pašas mikrobu šūnas pielīp tieši. Šo aglutināciju sauc par smalkgraudainu. Tas notiek 18-22 stundu laikā. v

Flagellate mikrobiem ir divi antigēni - somatiskais O-antigēns un flagellārais H-antigēns. Ja šūnas salīp kopā ar flagellas, veidojas lielas irdenas pārslas, un šo aglutinācijas reakciju sauc par rupji graudainu. Tas notiek 2 līdz 4 stundu laikā.

Aglutinācijas reakciju var iestatīt gan specifisku antivielu kvalitatīvai un kvantitatīvai noteikšanai pacienta asins serumā, gan izolētā patogēna sugas noteikšanai. v

Aglutinācijas reakciju var iestatīt gan paplašinātā versijā, kas ļauj strādāt ar serumu, kas atšķaidīts līdz diagnostikas titram, gan orientācijas reakcijas veidā, kas principā ļauj noteikt specifiskas antivielas vai noteikt sugas. patogēns.

Uzstādot detalizētu aglutinācijas reakciju, lai izmeklējamās personas asins serumā noteiktu specifiskas antivielas, ņem testa serumu atšķaidījumā 1:50 vai 1:100. Tas ir saistīts ar faktu, ka normālas antivielas var atrast ļoti augstā koncentrācijā veselā vai nedaudz atšķaidītā serumā, un tad reakcijas rezultāti var būt neprecīzi. Pārbaudes materiāls šim reakcijas variantam ir pacienta asinis.

Asinis tiek ņemtas tukšā dūšā vai ne agrāk kā 6 stundas pēc ēšanas (pretējā gadījumā asins serumā var būt tauku pilieni, padarot to duļķainu un pētniecībai nepiemērotu). Pacienta asins serumu parasti iegūst slimības otrajā nedēļā, sterili no kubitālās vēnas savācot 3-4 ml asiņu (līdz šim laikam ir koncentrēts maksimālais specifisko antivielu daudzums). Kā zināms antigēns tiek izmantots diagnostikas līdzeklis, kas sagatavots no nogalinātām, bet neiznīcinātām konkrētas sugas mikrobu šūnām ar specifisku antigēnu struktūru.

Veicot detalizētu aglutinācijas reakciju, lai noteiktu patogēna sugu, veidu, antigēns ir dzīvs patogēns, kas izolēts no testa materiāla. Ir zināmas imūndiagnostikas serumā esošās antivielas. v

Imūndiagnostikas serumu iegūst no vakcinēta truša asinīm. Pēc titra noteikšanas (maksimālais atšķaidījums, kurā tiek noteiktas antivielas), diagnostikas serumu ielej ampulās, pievienojot konservantu. Šo serumu izmanto, lai identificētu izolēto patogēnu pēc antigēnās struktūras.

AGLUTINĀCIJAS REAKCIJAS IESPĒJAS

Šajās reakcijās piedalās antigēni daļiņu veidā (mikrobu šūnas, eritrocīti un citi korpuskulārie antigēni), kas ar antivielu palīdzību tiek salīmēti kopā un izgulsnējas.

Lai formulētu aglutinācijas reakciju (RA), nepieciešami trīs komponenti: 1) antigēns (aglutinogēns); 2) antiviela (aglutinīns) un 3) elektrolīts (izotonisks nātrija hlorīda šķīdums).

REFERENCE (PLĀKSNE) AGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RA)

Provizoriskais jeb slāņveida RA tiek novietots uz stikla priekšmetstikliņa istabas temperatūrā. Šim nolūkam uz stikla ar Pasteur pipeti uzpilina seruma pilienu atšķaidījumā 1:10 - 1:20 un izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma kontroles pilienu. Vienā un otrā ar bakterioloģisko cilpu ievada kolonijas vai ikdienas baktēriju kultūru (diagnostikas pilienu) un rūpīgi sajauc. Reakcijas tiek ņemtas vērā pēc dažām minūtēm vizuāli, dažreiz izmantojot palielināmo stiklu (x5). Ar pozitīvu RA pilē ar serumu tiek novērotas lielas un mazas pārslas, ar negatīvu RA serums paliek vienmērīgi duļķains.

NETIEŠĀ (PASĪVĀ) HEMAGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RNGA, RPGA)

Reakcija tiek iestatīta: 1) noteikt polisaharīdus, proteīnus, baktēriju ekstraktus un citas ļoti izkliedētas vielas, riketsijas un vīrusus, kuru kompleksi ar aglutinīniem nav redzami pie parastā RA, vai 2) noteikt antivielas pacientu serumā. šīm ļoti izkliedētajām vielām un sīkajiem mikroorganismiem.

Netiešo jeb pasīvo aglutināciju saprot kā reakciju, kurā antivielas mijiedarbojas ar antigēniem, kas iepriekš adsorbēti uz inertajām daļiņām (latekss, celuloze, polistirols, bārija oksīds u.c. vai aitas eritrocīti, I (0) – cilvēka asinsgrupas).

Pasīvās hemaglutinācijas (RPHA) reakcijā eritrocītus izmanto kā nesēju. Ar antigēnu noslogotie eritrocīti salīp kopā specifisku antivielu klātbūtnē pret šo antigēnu un izgulsnējas. Antigēnu sensibilizētie eritrocīti tiek izmantoti RPHA kā eritrocītu diagnostikas līdzeklis antivielu noteikšanai (serodiagnostika). Ja eritrocītus noslogo ar antivielām (eritrocītu antivielu diagnostika), tad to var izmantot antigēnu noteikšanai.

Paziņojums, apgalvojums. Seruma sērijas atšķaidījumus sagatavo polistirola plākšņu iedobēs. Priekšpēdējā iedobē pievienojiet 0,5 ml acīmredzami pozitīva seruma un 0,5 ml fizioloģiskā šķīduma (kontroles) pēdējā iedobē. Pēc tam visām iedobēm pievieno 0,1 ml atšķaidīta eritrocītu diagnostikas šķīduma, sakrata un ievieto termostatā uz 2 stundām.

Grāmatvedība. Pozitīvā gadījumā eritrocīti nosēžas cauruma apakšā vienmērīga šūnu slāņa veidā ar salocītu vai robainu malu (apgriezts lietussargs), negatīvā gadījumā tie nosēžas pogas vai gredzena veidā. .

1.2. NEITRALIZĀCIJAS REAKCIJA. LIZISA,
OPSONO-FAGOCĪTISKA REAKCIJA, PAaugstinātas jutības reakcija

EKSOTOKSĪNA NEITRALIZĀCIJAS REAKCIJA AR ANTITOKSĪNU (PH)

Reakcija balstās uz antitoksiskā seruma spēju neitralizēt eksotoksīna darbību. To izmanto antitoksisko serumu titrēšanai un eksotoksīna noteikšanai.

Titrējot serumu, dažādiem antitoksiskā seruma atšķaidījumiem tiek pievienota noteikta attiecīgā toksīna deva. Ar pilnīgu antigēna neitralizāciju un neizmantotu antivielu trūkumu notiek sākotnējā flokulācija. Flokulācijas reakciju var izmantot ne tikai seruma titrēšanai (piemēram, difterijai), bet arī toksīna un toksoīda titrēšanai. Toksīna neitralizācijas reakcijai ar antitoksīnu ir liela praktiska nozīme kā metodei antitoksisku zāļu serumu aktivitātes noteikšanai. Šīs reakcijas antigēns ir īsts eksotoksīns.

Antitoksiskā seruma stiprumu nosaka parastās AE mērvienības.

1 AU botulīna seruma – tā daudzums neitralizē 1000 DLM botulīna toksīna. Neitralizācijas reakciju, lai noteiktu eksotoksīna sugu vai veidu (diagnosticējot stingumkrampjiem, botulismu, difteriju u.c.), var veikt in vitro (pēc Ramona), bet, nosakot mikrobu šūnu toksicitāti - gēlā ( saskaņā ar Ouchterloni).

Līzes reakcija (RL)

Viena no imūnseruma aizsargājošajām īpašībām ir tā spēja izšķīdināt mikrobus vai šūnu elementus, kas nonāk organismā.

Specifiskas antivielas, kas izraisa šūnu izšķīšanu (līzi), sauc par lizīniem. Atkarībā no antigēna rakstura tie var būt bakteriolizīni, citolizīni, spirochetolizīni, hemolizīni utt.

Lizīni parāda savu iedarbību tikai papildu faktora - komplementa klātbūtnē. Komplements kā nespecifiskas humorālās imunitātes faktors ir atrodams gandrīz visos ķermeņa šķidrumos, izņemot cerebrospinālo šķidrumu un šķidrumu acs priekšējā kamerā. Cilvēka serumā tiek novērots diezgan augsts un nemainīgs komplementa saturs, un jūrascūciņu asins serumā tā ir daudz. Citiem zīdītājiem seruma komplementa saturs ir atšķirīgs.

Komplements ir sarežģīta sūkalu olbaltumvielu sistēma. Tas ir nestabils un sadalās 55 grādu temperatūrā 30 minūšu laikā. Istabas temperatūrā komplements tiek iznīcināts divu stundu laikā. Ļoti jutīgs pret ilgstošu kratīšanu, skābēm un ultravioletajiem stariem. Tomēr komplements saglabājas sauss ilgu laiku (līdz sešiem mēnešiem) zemā temperatūrā. Komplements veicina mikrobu šūnu un eritrocītu līzi.

Izšķir bakteriolīzes un hemolīzes reakciju.

Bakteriolīzes reakcijas būtība ir tāda, ka, komplementa klātbūtnē kombinējot specifisku imūnserumu ar tam atbilstošajām homologajām dzīvajām mikrobu šūnām, notiek mikrobu līze.

Hemolīzes reakcija sastāv no tā, ka, ja eritrocīti tiek pakļauti specifiskam serumam, kas ir imūns pret tiem (hemolītisks) komplementa klātbūtnē, tiek novērota eritrocītu izšķīšana, t.i. hemolīze.

Hemolīzes reakciju laboratorijas praksē izmanto, lai noteiktu komplementa tyr, kā arī ņemtu vērā diagnostisko komplementa saistīšanās reakciju rezultātus. Komplementa titrs ir mazākais tā daudzums, kas izraisa eritrocītu sabrukšanu 30 minūšu laikā hemolītiskajā sistēmā 2,5 ml tilpumā. Līzes reakcija, tāpat kā visas seroloģiskās reakcijas, notiek elektrolīta klātbūtnē.

PAaugstinātas jutības reakcijas (ALERĢISKAS)

Dažas antigēna formas, atkārtoti saskaroties ar ķermeni, var izraisīt reakciju, kas pamatā ir specifiska, bet ietver nespecifiskus akūtas iekaisuma reakcijas šūnu un molekulāros faktorus. Ir zināmas divas hiperreaktivitātes formas: tūlītēja tipa hipersensitivitāte (HHT) un aizkavētā tipa hipersensitivitāte (HAT). Pirmā veida reakcija izpaužas ar antivielu līdzdalību, un reakcija attīstās ne vēlāk kā 2 stundas pēc atkārtotas saskares ar alergēnu. Otrs veids tiek realizēts ar iekaisuma T-šūnu (Trzt) palīdzību kā galvenajiem reakcijas efektoriem, nodrošinot makrofāgu uzkrāšanos iekaisuma zonā, reakcija izpaužas pēc 6-8 stundām un vēlāk.

Pirms paaugstinātas jutības reakcijas attīstības notiek tikšanās ar antigēnu un sensibilizācijas rašanās, t.i. antivielu parādīšanās, aktīvi sensibilizēti limfocīti un pasīvi sensibilizēti ar citu leikocītu (makrofāgu, granulocītu) citofīlajām antivielām.

Paaugstinātas jutības reakcijām ir trīs attīstības fāzes: imunoloģiskās; patoķīmisks; patofizioloģiska.

Pirmajā, specifiskajā fāzē alergēns mijiedarbojas ar antivielām un/vai sensibilizētām šūnām. Otrajā fāzē no aktivizētajām šūnām izdalās bioloģiski aktīvās vielas. Izdalītie mediatori (histamīns, serotonīns, leikotriēni, bradikinīns u.c.) izraisa dažādus perifēros efektus, kas raksturīgi atbilstošajam reakcijas veidam – trešajai fāzei.

4. tipa paaugstinātas jutības reakcijas

Šāda veida reakcijas izraisa sensibilizēto T-helperu, citotoksisko T-limfocītu (T-killeru) un mononukleāro fagocītu sistēmas aktivēto šūnu patogēna starpšūnu mijiedarbība, ko izraisa ilgstoša imūnsistēmas stimulēšana ar baktēriju antigēniem, kuros atrodas ķermeņa imūnsistēmas relatīvā nepietiekamība, lai likvidētu baktēriju patogēnus no iekšējās vides infekcijas slimībām. Šīs paaugstinātas jutības reakcijas pacientiem ar tuberkulozi izraisa tuberkulozus plaušu dobumus, to kazeozo nekrozi un vispārēju intoksikāciju. Ādas granulomatoze tuberkulozes un spitālības gadījumā morfopatoģenētiskā ziņā lielākoties sastāv no ceturtā tipa paaugstinātas jutības reakcijām.

Slavenākais ceturtā tipa paaugstinātas jutības reakcijas piemērs ir Mantoux reakcija, kas attīstās tuberkulīna intradermālās ievadīšanas vietā pacientam, kura ķermenis un sistēma ir sensibilizēta pret mikobaktēriju antigēniem. Reakcijas rezultātā veidojas blīva hiperēmiska papula ar nekrozi centrā, kas parādās tikai dažas stundas (lēnām) pēc tuberkulīna intradermālās injekcijas. Papulu veidošanās sākas ar izeju no asinsvadu gultnes cirkulējošo asiņu mononukleāro fagocītu starpšūnu telpās. Vienlaikus sākas polimorfonukleāro šūnu emigrācija no asinsvadu gultnes. Tad neitrofilo leikocītu infiltrācija samazinās, un infiltrāts pārsvarā sastāv no limfocītiem un mononukleāriem fagocītiem. Šajā ziņā Mantoux reakcija atšķiras no Artusa reakcijas, kurā polimorfonukleārie leikocīti pārsvarā uzkrājas bojājuma vietā.

Ar ceturtā tipa paaugstinātas jutības reakcijām ilgstoša sensibilizēto limfocītu stimulēšana ar antigēniem izraisa patoloģiski intensīvu un ilgstošu citokīnu izdalīšanos no T-palīgiem patoloģisku izmaiņu vietās audos. Intensīvā citokīnu izdalīšanās audu bojājumu vietās izraisa tur esošās mononukleāro fagocītu sistēmas šūnu hiperaktivāciju, no kurām daudzas hiperaktivētā stāvoklī veido epitēlija šūnu auklas, bet dažas saplūst savā starpā, veidojot milzu šūnas. Makrofāgi, uz kuru virsmas ir pakļauti baktēriju un vīrusu antigēniem, var tikt iznīcināti, darbojoties T-killeriem (dabiskām killer šūnām).

Ceturto veidu paaugstinātas jutības reakcijas izraisa sveša baktēriju antigēna atpazīšana, ko veic T-palīgi, kas ir jutīgi pret to. Nepieciešams nosacījums atpazīšanai ir induktoru mijiedarbība ar antigēniem, kas pakļauti antigēnu prezentējošu šūnu virsmai pēc endocitozes un svešu imunogēnu apstrādes ar mononukleāro fagocītu palīdzību. Vēl viens nepieciešams nosacījums ir antigēnu iedarbība kompleksā ar I klases molekulām no galvenā audu saderības kompleksa. Pēc antigēna atpazīšanas sensibilizētie palīgi atbrīvo citokīnus un jo īpaši interleikīnu-2, kas aktivizē dabiskās killer šūnas un mononukleāros fagocītus. Aktivizētie mononukleārie fagocīti atbrīvo proteolītiskos enzīmus un brīvos skābekļa radikāļus, kas bojā audus.

Ādas un alerģiskie testi - testi organisma sensibilizācijas noteikšanai pret alergēniem, tā infekcijas noteikšanai, piemēram, tuberkuloze, bruceloze, kolektīvās imunitātes līmenis, piemēram, pret tularēmiju. Alergēna ievadīšanas vietā izšķir: 1) ādas izmeklējumus; 2) skarifikācija; 3) intradermāli; 4) zemādas. Klīniskā reakcija uz alergēnu ādas alerģiskajā testā tiek iedalīta vietējā, vispārējā un fokusa, kā arī tūlītējā un aizkavētā.

HNT mediatora tipa lokālas reakcijas rodas pēc 5–20 minūtēm, izpaužas eritēmas un tulznas veidā, izzūd pēc dažām stundām un tiek novērtētas ar pozitīvu metodi pēc eritēmas lieluma, mērot mm. Vietējās HAT reakcijas rodas pēc 24-48 stundām, ilgst ilgu laiku, parādās kā infiltrāts, dažkārt ar nekrozi centrā, tiek novērtētas pēc infiltrāta lieluma mm, arī pēc plus sistēmas. Citotoksisku un imūnkompleksu HNT veidu gadījumā hiperēmija un infiltrācija tiek novērota pēc 3-4 stundām, maksimums sasniedz 6-8 stundas un samazinās apmēram pēc dienas. Dažreiz tiek novērotas kombinētas reakcijas.

1.3. PAPILDINĀŠANAS REAKCIJA (RSK)

Šo reakciju izmanto laboratorijas pētījumos, lai noteiktu antivielas asins serumā dažādām infekcijām, kā arī identificētu patogēnu pēc tā antigēnās struktūras.

Komplementa saistīšanas tests ir sarežģīta seroloģiska reakcija, un tā ir ļoti jutīga un specifiska.

Šīs reakcijas iezīme ir tāda, ka antigēna izmaiņas, kad tas mijiedarbojas ar specifiskām antivielām, notiek tikai komplementa klātbūtnē. Komplements tiek adsorbēts tikai uz antivielas-antigēna kompleksa. Antivielu-antigēna komplekss veidojas tikai tad, ja pastāv afinitāte starp antigēnu un antivielu serumā.

Komplementa adsorbcija uz kompleksa "antigēns-antiviela" var ietekmēt antigēna likteni dažādos veidos, atkarībā no tā īpašībām.

Dažos antigēnos šajos apstākļos notiek asas morfoloģiskas izmaiņas, līdz izšķīšanai (hemolīze, Isajeva-Pfeifera fenomens, citolītiska darbība). Citi maina kustības ātrumu (treponēmu imobilizācija). Vēl citi mirst bez asām destruktīvām izmaiņām (baktericīda vai citotoksiska iedarbība). Visbeidzot, komplementa adsorbcija var nebūt saistīta ar viegli novērojamām antigēnu izmaiņām.

Saskaņā ar RSC mehānismu tas notiek divos posmos:

1. Pirmā fāze ir antigēna-antivielu kompleksa veidošanās un adsorbcija uz šī komplementa kompleksa. Fāzes rezultāts nav vizuāli redzams (antigēna un antivielu mijiedarbība ar obligātu komplementa līdzdalību).
2. Otrā fāze ir antigēna izmaiņas specifisku antivielu ietekmē komplementa klātbūtnē. Fāzes rezultāts var būt vizuāli redzams vai neredzams (reakcijas rezultātu identificēšana, izmantojot indikatoru hemolītisko sistēmu (aitas eritrocītus un hemolītisko serumu).

Eritrocītu iznīcināšana ar hemolītisko serumu notiek tikai tad, ja hemolītiskajai sistēmai ir pievienots komplements. Ja komplements iepriekš tika adsorbēts uz antigēna-antivielu kompleksa, tad eritrocītu hemolīze nenotiek.

Eksperimenta rezultātu novērtē, atzīmējot hemolīzes esamību vai neesamību visās mēģenēs. Reakcija tiek uzskatīta par pozitīvu ar pilnīgu hemolīzes aizkavēšanos, kad mēģenē esošais šķidrums ir bezkrāsains un eritrocīti nosēžas apakšā, negatīva - ar pilnīgu eritrocītu līzi, kad šķidrums ir intensīvi krāsots ("lakas" asinis). Hemolīzes aizkavēšanās pakāpi novērtē atkarībā no šķidruma krāsas intensitātes un eritrocītu nogulumu daudzuma apakšā (++++, +++, ++, +).

Gadījumā, ja antigēna izmaiņas paliek vizuālai novērošanai nepieejamas, ir jāizmanto otra sistēma, kas pilda indikatora lomu, kas ļauj novērtēt komplementa stāvokli un izdarīt secinājumu par pārbaudes rezultātu. reakcija.

Šo indikatoru sistēmu attēlo hemolīzes reakcijas komponenti, kas ietver aitu eritrocītus un hemolītisko serumu, kas satur specifiskas antivielas (hemolizīnus) pret eritrocītiem, bet nesatur komplementu. Šī indikatoru sistēma tiek pievienota caurulēm stundu pēc galvenā RSK uzstādīšanas. Ja komplementa saistīšanās reakcija ir pozitīva, tad veidojas antivielas-antigēna komplekss, kas komplementu adsorbē uz sevi. Tā kā komplements tiek izmantots tādā daudzumā, kāds nepieciešams tikai vienai reakcijai, un eritrocītu līze var notikt tikai komplementa klātbūtnē, kad tas adsorbējas uz antigēna-antivielu kompleksa, eritrocītu līze hemolītiskajā (indikatora) sistēmā nenotiks. . Ja komplementa saistīšanās reakcija ir negatīva, antigēna-antivielu komplekss neveidojas, komplements paliek brīvs, un, pievienojot hemolītisko sistēmu, notiek eritrocītu līze.

1.4. DNS ZONDES. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR),
IMŪNOENZĪMĀ METODE (ELISA), ANTIVIELU fluorescēšanas metode (MFA)

GĒNU SENĒŠANAS METODES

Molekulārās bioloģijas intensīva attīstība un ideālas metodiskās bāzes izveide gēnu pētījumiem bija gēnu inženierijas pamatā. Diagnostikas jomā ir izveidojies un strauji attīstās virziens specifisku DNS un RNS nukleotīdu secību noteikšanai, tā sauktā gēnu zondēšana. Šo paņēmienu pamatā ir nukleīnskābju spēja hibridizēties – divpavedienu struktūru veidošanās komplementāru nukleotīdu (A – T, G – C) mijiedarbības rezultātā.

Lai noteiktu vēlamo DNS (vai RNS) secību, tiek speciāli izveidota tā sauktā polinukleotīdu zonde ar noteiktu bāzes secību. Tā sastāvā ir ieviesta īpaša etiķete, kas ļauj identificēt kompleksa veidošanos.

Lai gan gēnu zondēšanu nevar klasificēt kā imūnķīmiskās analīzes metodes, tās galvenais princips (komplementāru struktūru mijiedarbība) tiek metodiski īstenots tāpat kā imūndiagnostikas indikatormetodes. Turklāt gēnu zondēšanas metodes ļauj papildināt informāciju par infekcijas izraisītāju, ja nav tā fenotipiskās ekspresijas (genomā iestrādāti vīrusi, “klusie” gēni).

DNS analīzei paraugu denaturē, lai iegūtu vienpavedienu struktūras, ar kurām reaģē DNS vai RNS zondes molekulas. Zondu sagatavošanai izmanto vai nu dažādus DNS (vai RNS) reģionus, kas izolēti no dabiska avota (piemēram, konkrēta mikroorganisma), kas parasti tiek prezentēti ģenētisko secību veidā vektoru plazmīdās, vai ķīmiski sintezētus oligonukleotīdus. Dažos gadījumos kā zonde tiek izmantoti genoma DNS preparāti, hidrolizēti fragmentos, dažreiz RNS, īpaši ribosomu RNS, preparāti. Kā etiķete tiek izmantoti tie paši indikatori kā dažāda veida imūnķīmiskajā analīzē: radioaktīvie izotopi, fluoresceīni, biotops (ar turpmāku avidīna-enzīma kompleksa izpausmi) utt.

Analīzes procedūru nosaka esošās zondes īpašības.

Arvien biežāk tiek izmantoti komerciāli komplekti, kas satur visas nepieciešamās sastāvdaļas.

Vairumā gadījumu analīzes procedūru var iedalīt šādos posmos: parauga sagatavošana (ieskaitot DNS ekstrakciju un denaturāciju), parauga fiksēšana uz nesēja (visbiežāk polimēra membrānas filtra), prehibridizācija, pati hibridizācija, nesaistīto produktu mazgāšana, un atklāšana. Ja nav standarta DNS vai RNS zondes sagatavošanas, tās sagatavošanu un marķēšanu veic iepriekš.

Lai sagatavotu paraugu, var būt nepieciešams iepriekš audzēt testa materiālu, lai identificētu atsevišķas baktēriju kolonijas vai palielinātu vīrusu koncentrāciju šūnu kultūrā. Tiek veikta arī tieša asins seruma, urīna, asins šūnu vai visu asiņu paraugu analīze, lai noteiktu infekcijas izraisītāja klātbūtni. Lai atbrīvotu nukleīnskābes no šūnu struktūru sastāva, tiek veikta šūnu līze, un dažos gadījumos DNS preparāts tiek attīrīts, izmantojot fenolu.

Ārstēšanas laikā ar sārmu notiek DNS denaturācija, tas ir, tās pāreja uz vienpavedienu formu. Pēc tam nukleīnskābes paraugu fiksē uz nesēja, nitrocelulozes vai neilona membrānas, parasti inkubējot 10 minūtes līdz 4 stundas 80 °C temperatūrā vakuumā. Turklāt prehibridizācijas procesā tiek panākta brīvo saistīšanās vietu inaktivācija, lai samazinātu zondes nespecifisko mijiedarbību ar membrānu. Hibridizācijas process ilgst no 2 līdz 20 stundām atkarībā no DNS koncentrācijas paraugā, izmantotās zondes koncentrācijas un tās lieluma.

Pēc hibridizācijas un nesaistīto produktu mazgāšanas beigām konstatē izveidoto kompleksu. Ja zonde satur radioaktīvu marķējumu, membrāna tiek pakļauta fotofilmai, lai parādītu reakciju (autoradiogrāfija). Citām etiķetēm izmantojiet atbilstošās procedūras.

Visdaudzsološākā ir neradioaktīvo (tā saukto auksto) zondu ražošana. Uz tā paša pamata tiek izstrādāta hibridizācijas tehnika, kas ļauj konstatēt patogēna klātbūtni sekciju preparātos, audu punktos, kas ir īpaši svarīgi patomorfoloģiskajā analīzē (in situ hibridizācija).

Būtisks posms gēnu zondēšanas metožu izstrādē bija polimerāzes amplifikācijas reakcijas (PCR) izmantošana. Šī pieeja ļauj palielināt noteiktas (iepriekš zināmas) DNS sekvences koncentrāciju paraugā, sintezējot vairākas kopijas in vitro. Lai veiktu reakciju, tiek iegūts DNS polimerāzes enzīma preparāts, dezoksinukleotīdu pārpalikums sintēzei un tā sauktie praimeri - divu veidu oligonukleotīdi ar vērtību 20-25 bāzes, kas atbilst interesējošās DNS sekvences gala reģioniem. - tiek pievienoti testa DNS paraugam. Vienam no praimeriem jābūt DNS kodējošās virknes nolasīšanas reģiona sākuma kopijai 5-3 nolasīšanas virzienā, bet otrai - nekodējošās virknes pretējā gala kopijai. Tad ar katru polimerāzes reakcijas ciklu DNS kopiju skaits dubultojas.

Lai veiktu praimeru saistīšanu, ir nepieciešama DNS denaturēšana (kušana) 94 ° C temperatūrā, kam seko maisījuma uzsildīšana līdz 40–55 ° C.

Reakcijas veikšanai ir izstrādāti programmējami mikroparaugu inkubatori, kas ļauj viegli mainīt temperatūras izmaiņas, kas ir optimālas katrai reakcijas stadijai.

Pastiprināšanas reakcija var ievērojami palielināt testa jutību gēnu zondēšanai, kas ir īpaši svarīgi pie zemas infekcijas izraisītāja koncentrācijas.

Viena no nozīmīgajām gēnu zondēšanas ar amplifikāciju priekšrocībām ir iespēja izpētīt submikroskopisku patoloģiskā materiāla daudzumu.

Vēl viena metodes iezīme, kas ir svarīgāka infekciozā materiāla analīzei, ir spēja identificēt slēptos (klusos) gēnus. Metodes, kas saistītas ar gēnu noteikšanas izmantošanu, noteikti tiks plašāk ieviestas infekcijas slimību diagnostikas praksē, jo tās kļūs vienkāršākas un lētākas.

ELISA un RIF metodes lielākoties ir kvalitatīvas vai daļēji kvantitatīvas. Pie ļoti zemām komponentu koncentrācijām antigēna-antivielu kompleksa veidošanos nevar noteikt ne vizuāli, ne ar vienkāršiem instrumentāliem līdzekļiem. Šādos gadījumos antigēna-antivielu kompleksu var norādīt, vienā no sākotnējām sastāvdaļām - antigēnu vai antivielu - ievietojot marķējumu, ko var viegli noteikt koncentrācijās, kas ir salīdzināmas ar noteikto analizējamās vielas koncentrāciju.

Kā marķējumu var izmantot radioaktīvos izotopus (piemēram, 125I), fluorescējošas vielas un fermentus.

Atkarībā no izmantotās etiķetes izšķir radioimmunotestu (RIA), fluorescent imūntestu (FIA), ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas testu (ELISA) analīzes metodes uc Pēdējos gados ELISA ir ieguvusi plašu praktisko pielietojumu, kas ir saistīts ar kvantitatīvu noteikšanu iespēja, augsta uzskaites jutība, specifika un automatizācija.

Imunoloģiskās analīzes metodes - metožu grupa, kas ļauj identificēt antigēna-antivielu kompleksu, izmantojot substrātu, ko šķeļ ferments ar krāsas izskatu.

Metodes būtība ir antigēna-antivielu reakcijas komponentu apvienošana ar izmērāmu enzīmu marķējumu. Antigēns vai antiviela, kas reaģē, ir marķēta ar fermentu. Pēc substrāta transformācijas fermenta iedarbībā var spriest par antigēna-antivielu reakcijas reaģējošās sastāvdaļas daudzumu. Ferments šajā gadījumā kalpo kā imūnās atbildes marķieris un ļauj to novērot vizuāli vai instrumentāli.

Fermenti ir ļoti ērtas etiķetes, jo to katalītiskās īpašības ļauj tiem darboties kā pastiprinātājiem, jo ​​viena fermenta molekula var veicināt vairāk nekā 1 × 105 katalītiskās reakcijas produkta molekulu veidošanos minūtē. Nepieciešams izvēlēties fermentu, kas ilgstoši saglabā savu katalītisko aktivitāti, nezaudē to, saistoties ar antigēnu vai antivielu, un kuram ir augsta specifika attiecībā pret substrātu.

Galvenās metodes antivielu vai ar enzīmu marķētu antigēnu ražošanai – konjugāti: ķīmiskie, imunoloģiskie un ģenētiski modificētie. ELISA testēšanai visbiežāk izmanto enzīmus: mārrutku peroksidāzi, sārmaino fosfatāzi, galaktozidāzi utt.

Lai noteiktu enzīma aktivitāti antigēna-antivielu kompleksā ar mērķi vizuāli un instrumentāli reģistrēt reakciju, tiek izmantoti hromogēnie substrāti, kuru šķīdumi, sākotnēji bezkrāsaini, fermentatīvās reakcijas laikā iegūst krāsu, kuras intensitāte. ir proporcionāls fermenta daudzumam. Tātad, lai noteiktu mārrutku peroksidāzes aktivitāti cietās fāzes ELISA testā, kā substrāts tiek izmantota 5-aminosalicilskābe, kas piešķir intensīvi brūnu krāsu, ortofenilēndiamīns, kas veido oranži dzeltenu krāsu. Sārmainās fosfatāzes un β-galatozidāzes aktivitātes noteikšanai izmanto attiecīgi nitrofenilfosfātus un nitrofenilgalaktozīdus.

Reakcijas rezultāts ar krāsaina produkta veidošanos tiek noteikts vizuāli vai izmantojot spektrofotometru, kas mēra gaismas absorbciju ar noteiktu viļņa garumu.

Ir zināmas daudzas ELISA iestatīšanas iespējas. Atšķirt homogēnos un neviendabīgos variantus.

Pēc iestatīšanas metodes izšķir konkurējošās un nekonkurējošās ELISA metodes. Ja pirmajā posmā sistēmā ir tikai analizētais savienojums un atbilstošās saistīšanās vietas (antigēns un specifiskās antivielas), tad metode ir nekonkurētspējīga. Ja analizētais savienojums (antigēns) un tā analogs (marķēts ar enzīma antigēnu) atrodas pirmajā posmā, konkurējot savā starpā par saistīšanos ar deficīta specifiskajām saistīšanās vietām (antivielām), tad metode ir konkurētspējīga. Šajā gadījumā, jo vairāk testa antigēna ir šķīdumā, jo mazāks ir saistošo iezīmēto antigēnu daudzums.

FLUORESCENCĒJO ANTIVIELU METODE (MFA) vai IMUNOFLUORSCENCES REAKCIJAS (RIF)

Imunofluorescences metode ir izvēles metode nezināma mikroorganisma ātrai noteikšanai un identificēšanai testa materiālā.

Ag + AT + elektrolīts = komplekss spīdums UV staros

Mikrobu serums, kas marķēts ar fluorohromu

Bieži tiek izmantota fluoresceīna izotiocianāta krāsa - FITC

Pārbaudot šo metodi, tiek izmantots fluorescējošais mikroskops.

RIF ražošana

Uztriepes uzklājiet 30 µl FITC iezīmētu antivielu šķīduma.

Novietojiet glāzi mitrā kamerā un inkubējiet istabas temperatūrā 20-25 minūtes vai termostatā 37 ° C temperatūrā 15 minūtes.

Glāzi 2 minūtes mazgā tekošā krāna ūdenī, noskalo ar destilētu ūdeni un žāvē gaisā.

Uz izžāvētās uztriepes uzpilina pilienu montāžas šķidruma, uztriepi pārklāj ar vāka stiklu un mikroskopē, izmantojot luminiscējošu mikroskopu vai luminiscējošu stiprinājumu pie parastā optiskā mikroskopa.

13.1. Antigēna-antivielu reakcijas un to izmantošana

Kad tiek injicēts antigēns, organismā veidojas antivielas. Antivielas papildina antigēnu, kas izraisīja to sintēzi, un spēj ar to saistīties. Antigēna-antivielu saistīšanās sastāv no divām fāzēm. Pirmā fāze ir specifiska, kurā notiek ātra antigēna determinanta saistīšanās ar antivielu Fab-fragmenta aktīvo centru. Jāņem vērā, ka saistīšanās notiek van der Vāla spēku, ūdeņraža un hidrofobās mijiedarbības dēļ. Saites stiprumu nosaka telpiskās atbilstības pakāpe starp antivielas aktīvo centru un antigēna epitopu. Pēc noteiktas fāzes iestājas lēnāka – nespecifiska fāze, kas izpaužas kā redzama fiziska parādība (piemēram, pārslu veidošanās aglutinācijas laikā u.c.).

Imūnās reakcijas ir mijiedarbība starp antivielām un antigēniem, un šīs reakcijas ir specifiskas un ļoti jutīgas. Tos plaši izmanto medicīnas praksē. Ar imūnreakciju palīdzību var atrisināt šādus uzdevumus:

Nezināmu antivielu noteikšana ar zināmiem antigēniem (antigenic diagnosticum). Šāds uzdevums ir nepieciešams, ja pacienta asins serumā nepieciešams noteikt antivielas pret patogēnu (serodiagnostika). Antivielu atrašana palīdz apstiprināt diagnozi;

Nezināmu antigēnu noteikšana ar zināmām antivielām (diagnostikas serums). Šis pētījums tiek veikts, identificējot no pacienta materiāla izolētā patogēna kultūru (serotipēšana), kā arī atklājot

mikrobu antigēni un to toksīni asinīs un citos bioloģiskajos šķidrumos. Ir daudz veidu imūnās atbildes, kas atšķiras pēc inscenēšanas tehnikas un reģistrētā efekta. Tās ir aglutinācijas reakcijas (RA), izgulsnēšanās (RP), reakcijas ar komplementu (RSC), reakcijas, kurās tiek izmantoti marķēti komponenti (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Aglutinācijas reakcija

Aglutinācijas reakcija (RA) ir imūnreakcija antigēna mijiedarbībai ar antivielām elektrolītu klātbūtnē, un antigēns atrodas korpuskulārā stāvoklī (eritrocīti, baktērijas, lateksa daļiņas ar adsorbētiem antigēniem). Aglutinācijas laikā korpuskulārie antigēni tiek salīmēti ar antivielām, kas izpaužas kā flokulentu nogulumu veidošanās. Flokulācija notiek tāpēc, ka antivielām ir divas aktīvās vietas, un antigēni ir polivalenti, t.i. ir vairāki antigēnu determinanti. RA izmanto, lai identificētu no pacienta materiāla izolētu patogēnu, kā arī noteiktu antivielas pret patogēnu pacienta asins serumā (piemēram, Raita un Hedlesona reakcijas brucelozes gadījumā, Vidala reakcija vēdertīfā un paratīfā).

Vienkāršākais RA inscenēšanas veids ir reakcija uz stikla, tas ir aptuvens RA, ko izmanto, lai noteiktu no pacienta izolētu patogēnu. Inscenējot reakciju, uz stikla priekšmetstikliņa tiek uzklāts diagnostiskais aglutinējošais serums (atšķaidījumā 1:10 vai 1:20), pēc tam ievada pacienta kultūru. Reakcija ir pozitīva, ja pilē parādās flokulējošas nogulsnes. Blakus tiek novietota kontrole: seruma vietā tiek uzklāts piliens nātrija hlorīda šķīduma. Ja diagnostiskais aglutinējošais serums nav adsorbēts 1, tad to atšķaida (līdz titram - atšķaidījumam, līdz kuram jānotiek aglutinācijai), t.i. ielieciet paplašināto RA mēģenēs, palielinoties

1 Neadsorbēts aglutinējošais serums var aglutinēt saistītās baktērijas, kurām ir kopīgi (savstarpēji reaģējoši) antigēni. Tāpēc viņi izmantoadsorbēti aglutinējošie serumi, no kuriem krusteniski reaģējošās antivielas ir noņemtas, adsorbējot ar tām radniecīgām baktērijām. Šādos serumos tiek saglabātas tikai šai baktērijai specifiskas antivielas.

aglutinējošā seruma atšķaidījumi, kam pievieno 2-3 pilienus no pacienta izolētas patogēna suspensijas. Aglutināciju ņem vērā pēc nogulšņu daudzuma un šķidruma dzidrības pakāpes mēģenēs. Reakciju uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju konstatē atšķaidījumā, kas ir tuvu diagnostikas seruma titram. Reakciju pavada kontroles: serumam, kas atšķaidīts ar izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumu, jābūt caurspīdīgam, mikrobu suspensijai tajā pašā šķīdumā jābūt vienmērīgi duļķainai, bez nogulsnēm.

Lai noteiktu antivielas pret patogēnu pacienta asins serumā, izmanto izvietoto RA. Kad tas ir ievietots mēģenēs, pacienta asins serums tiek atšķaidīts un mēģenēs tiek pievienots vienāds daudzums diagnostikas suspensijas (nogalināto mikrobu suspensijas). Pēc inkubācijas nosaka augstāko seruma atšķaidījumu, pie kura notiek aglutinācija, t.i. veidojas nogulsnes (seruma titrs). Šajā gadījumā aglutinācijas reakcija ar O-diagnosticum (karsējot iznīcina baktērijas, saglabājot termostabilo O-antigēnu) notiek smalkgraudainas aglutinācijas veidā. Aglutinācijas reakcija ar H-diagnosticum (baktērijas, ko iznīcina formalīns, kas saglabāja termolabilu flagellar H-antigēnu) ir liela kokvilna un norit ātrāk.

Netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija(RNGA vai RPGA) ir RA veids. Šī metode ir ļoti jutīga. Ar RNGA palīdzību iespējams atrisināt divas problēmas: noteikt antivielas pacienta asins serumā, kam pievienots antigēns eritrocītu diagnostikas līdzeklis, kas ir eritrocīti, uz kuriem adsorbējas zināmie antigēni; nosaka antigēnu klātbūtni testa materiālā. Šajā gadījumā reakciju dažreiz sauc par reverso netiešo hemaglutinācijas reakciju (RONGA). Stadējot, testa materiālam pievieno antivielu eritrocītu diagnostiku (eritrocītus, kuru virsmā ir adsorbētas antivielas). Šajā reakcijā eritrocīti darbojas kā nesēji un ir pasīvi iesaistīti imūnagregātu veidošanā. Pozitīvas reakcijas gadījumā pasīvi salīmēti eritrocīti nosedz akas dibenu ar vienmērīgu slāni ar šķembām malām ("lietussargu"); ja nav aglutinācijas, eritrocīti uzkrājas cauruma centrālajā padziļinājumā, veidojot kompaktu "pogu" ar asi izteiktām malām.

Koaglutinācijas reakcija izmanto, lai noteiktu patogēna šūnas (antigēnus), izmantojot antivielas, kas adsorbētas uz Staphylococcus aureus, kas satur proteīnu A. Proteīnam A ir afinitāte pret imūnglobulīnu Fc fragmentu. Pateicoties tam, antivielas saistās ar stafilokoku netieši caur Fc fragmentu, un Fab fragmenti ir vērsti uz āru un spēj mijiedarboties ar attiecīgajiem mikrobiem, kas izolēti no pacientiem. Tādējādi veidojas pārslas.

Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (RTGA) izmanto vīrusu infekciju diagnostikā un tikai hemaglutinējošu vīrusu izraisītas infekcijas. Šo vīrusu virsmā ir proteīns - hemaglutinīns, kas ir atbildīgs par hemaglutinācijas reakciju (RHA), kad vīrusiem tiek pievienotas sarkanās asins šūnas. RTGA sastāv no vīrusu antigēnu bloķēšanas ar antivielām, kā rezultātā vīrusi zaudē spēju aglutinēt eritrocītus.

Kumbsa reakcija - RA nepilnīgu antivielu noteikšanai. Dažās infekcijas slimībās, piemēram, ar brucelozi, pacienta asins serumā cirkulē nepilnīgas antivielas pret patogēnu. Nepilnīgas antivielas sauc par bloķējošām antivielām, jo ​​tām ir viena antigēna saistīšanās vieta, nevis divas kā pilnas antivielas. Tāpēc, pievienojot antigēnu diagnostiku, nepilnīgās antivielas saistās ar antigēniem, bet nesalīmē tās kopā. Reakcijas izpausmei tiek pievienots antiglobulīna serums (antivielas pret cilvēka imūnglobulīniem), kas novedīs pie imūnkompleksu (antigēna diagnostika + nepilnīgas antivielas), kas veidojas pirmajā reakcijas stadijā, aglutinācijas.

Netiešo Kumbsa reakciju lieto pacientiem ar intravaskulāru hemolīzi. Dažiem no šiem pacientiem tiek konstatētas nepilnīgas monovalentas anti-rēzus antivielas. Tie īpaši mijiedarbojas ar atkārtoti pozitīviem eritrocītiem, bet neizraisa to aglutināciju. Tāpēc anti-rēzus antivielu + Rh-pozitīvo eritrocītu sistēmai tiek pievienots antiglobulīna serums, kas izraisa eritrocītu aglutināciju. Ar Kumbsa reakcijas palīdzību tiek diagnosticēti patoloģiski stāvokļi, kas saistīti ar imūnās ģenēzes eritrocītu intravaskulāru līzi, piemēram, jaundzimušā hemolītiskā slimība, ko izraisa Rh-konflikts.

RA asins grupu noteikšanai pamatojoties uz eritrocītu aglutināciju ar imūnseruma antivielām pret A (II), B (III) asinsgrupu antigēniem. Kontrole ir serums bez antivielām, t.i. seruma AB (IV) asinsgrupa un A (P) un B (III) grupas eritrocītu antigēni. 0 (I) grupas eritrocīti tiek izmantoti kā negatīva kontrole, jo tiem nav antigēnu.

Lai noteiktu Rh faktoru, tiek izmantoti anti-Rh serumi (vismaz divas dažādas sērijas). Rh antigēna klātbūtnē uz pētāmo eritrocītu membrānas notiek šo šūnu aglutinācija.

13.3. Nokrišņu reakcija

RP ir imūnreakcija no antivielu mijiedarbības ar antigēniem elektrolītu klātbūtnē, un antigēns ir šķīstošā stāvoklī. Nokrišņu laikā notiek šķīstošo antigēnu nogulsnēšanās ar antivielām, kas izpaužas kā duļķainība nokrišņu joslu veidā. Redzamu nogulšņu veidošanos novēro, ja abus reaģentus sajauc līdzvērtīgās proporcijās. Viena no tām pārpalikums samazina nogulsnēto imūnkompleksu daudzumu. Ir dažādi veidi, kā inscenēt nokrišņu reakciju.

Gredzena nokrišņu reakcija ievieto maza diametra nokrišņu caurulēs. Imūnserumu ievada mēģenē un rūpīgi noslāņo šķīstošo antigēnu. Ja rezultāts ir pozitīvs, uz abu šķīdumu robežas veidojas pienains gredzens. Gredzenu izgulsnēšanās reakciju, kas nosaka antigēnu klātbūtni orgānos un audos, kuru ekstraktus vāra un filtrē, sauc par termiskās izgulsnēšanas reakciju (Ascoli reakcija, lai noteiktu termostabilo Sibīrijas mēra antigēnu).

Ouchterloni dubultā imūndifūzijas reakcija.Šo reakciju veic uz agara želejas. Iedobes tiek izgrieztas vienāda biezuma gēla slānī noteiktā attālumā vienu no otras un piepildītas ar attiecīgi antigēnu un imūnserumu. Pēc tam antigēni un antivielas izkliedējas gēlā, satiekas viens ar otru un veido imūnkompleksus, kas nogulsnējas gēlā un kļūst redzami kā līnijas.

uzturs. Šo reakciju var izmantot nezināmu antigēnu vai antivielu noteikšanai, kā arī dažādu antigēnu līdzības pārbaudei: ja antigēni ir identiski, tad nokrišņu līnijas saplūst, ja antigēni nav identiski, nokrišņu līnijas krustojas, ja antigēni ir identiski. daļēji identisks, veidojas spurs.

Radiāla imūndifūzijas reakcija. Izkausētajam agara gēlam pievieno antivielas un želeju vienmērīgi izklāj uz stikla. Želejā izgriež iedobes un tajās ievada dažādu koncentrāciju antigēnu šķīdumu standarta tilpumu. Inkubācijas laikā antigēni izkliedējas radiāli no iedobes un, saskaroties ar antivielām, veido nokrišņu gredzenu. Kamēr akā ir antigēna pārpalikums, nokrišņu gredzena diametrs pakāpeniski palielinās. Šo metodi izmanto, lai noteiktu antigēnus vai antivielas testa šķīdumā (piemēram, lai noteiktu dažādu klašu imūnglobulīnu koncentrāciju asins serumā).

Imūnelektroforēze. Antigēnu maisījumu sākotnēji atdala ar elektroforēzi, pēc tam proteīnu kustības virzienā rievā ievada nogulsnējošu antiserumu. Antigēni un antivielas izkliedējas želejā viens pret otru; mijiedarbojoties, tie veido lokveida nokrišņu līnijas.

Flokulācijas reakcija(pēc Ramona) - nokrišņu reakcijas veids, ko izmanto, lai noteiktu antitoksiskā seruma vai toksoīda aktivitāti. Reakciju veic mēģenēs. Mēģenē, kur toksoīds un antitoksīns ir līdzvērtīgā attiecībā, tiek novērota duļķainība.

13.4. Komplementa saistīšanās reakcija

Antivielas, kas mijiedarbojas ar atbilstošo antigēnu, saista pievienoto komplementu (1. sistēma). Komplementa saistīšanās indikators ir eritrocīti, kas sensibilizēti ar hemolītisko serumu, t.i. antivielas pret eritrocītiem (2. sistēma). Ja papildinājums nav fiksēts 1. sistēmā, t.i. nenotiek antigēna-antivielu reakcija, tad sensibilizētie eritrocīti tiek pilnībā lizēti (negatīva reakcija). Kad komplementu saistās ar 1. sistēmas imūnkompleksiem pēc sensibilizētu eritrocītu pievienošanas, hemolīze no plkst.

klāt (pozitīva reakcija). Komplementa saistīšanās reakciju izmanto, lai diagnosticētu infekcijas slimības (gonoreju, sifilisu, gripu utt.).

13.5. Neitralizācijas reakcija

Mikrobiem un to toksīniem ir kaitīga ietekme uz cilvēka ķermeņa orgāniem un audiem. Antivielas spēj saistīties un bloķēt šos kaitīgos aģentus, t.i. neitralizēt. Neitralizācijas diagnostikas reakcija balstās uz šo antivielu pazīmi. To veic, ievadot dzīvniekiem vai jutīgiem testa objektiem (šūnu kultūrai, embrijiem) antigēnu-antivielu maisījumu. Piemēram, lai noteiktu toksīnus pacienta materiālā, 1. grupas dzīvniekiem injicē pacienta materiālu. 2. grupas dzīvnieki tiek injicēti ar līdzīgu materiālu, iepriekš apstrādāti ar atbilstošu antiserumu. 1. grupas dzīvnieki iet bojā toksīna klātbūtnē materiālā. Otrā dzīvnieku grupa izdzīvo, toksīna kaitīgā iedarbība neizpaužas, jo tas tiek neitralizēts.

13.6. Reakcijas, izmantojot marķētas antivielas vai antigēnus

13.6.1. Imunofluorescences reakcija (RIF, Kūnsa metode)

Šo metodi izmanto ekspresdiagnostikai. Tas var noteikt gan mikrobu antigēnus, gan antivielas.

Tiešā RIF metode- imūnreakcija pret antivielu mijiedarbību ar antigēniem, un antivielas tiek marķētas ar fluorohromu - vielu, kas spēj izstarot noteikta viļņa garuma gaismas kvantus, kad trāpa noteikta viļņa garuma gaisma. Šīs metodes formulējuma īpatnība ir nepieciešamība noņemt nereaģējušās sastāvdaļas, lai izslēgtu nespecifiskas luminiscences noteikšanu. Šim nolūkam nereaģējušās antivielas tiek nomazgātas. Rezultātus novērtē, izmantojot fluorescējošu mikroskopu. Ar šādu luminiscējošu serumu apstrādātā uztriepē baktērijas mirdz uz tumša fona gar šūnas perifēriju.

Netiešā RIF metode izmantots biežāk nekā iepriekšējais. Šī reakcija tiek veikta divos posmos. Pirmajā posmā antigēni mijiedarbojas

Pārveidojiet ar atbilstošām antivielām, lai izveidotu imūnkompleksus. Visas sastāvdaļas, kas nav reaģējušas (t.i., nav imūnkompleksos), ir jānoņem, mazgājot. Otrajā posmā izveidoto antigēna-antivielu kompleksu nosaka, izmantojot fluorohromētu antiglobulīna serumu. Rezultātā veidojas komplekss mikrobs + pretmikrobu trušu antivielas + antivielas pret trušu imūnglobulīniem, kas marķēti ar fluorohromu. Rezultātus novērtē, izmantojot fluorescējošu mikroskopu.

13.6.2. Imunoloģiskās analīzes metode vai analīze

ELISA ir visizplatītākā mūsdienu metode, ko izmanto vīrusu, baktēriju, vienšūņu infekciju diagnosticēšanai, jo īpaši HIV infekcijas, vīrusu hepatīta u.c. diagnosticēšanai.

Ir daudz ELISA modifikāciju. Plaši tiek izmantota cietās fāzes nekonkurējošā ELISA versija. To veic 96 bedrīšu polistirola plāksnēs (cietā fāze). Veicot reakciju, katrā posmā ir jānomazgā neizreaģējušās sastāvdaļas. Nosakot antivielas, iedobēs, kurās tiek sorbēti antigēni, ievada testa asins serumu, pēc tam ar fermentu marķē antiglobulīna serumu. Viņi reaģē, pievienojot substrātu fermentam. Fermenta klātbūtnē substrāts mainās, un enzīma-substrāta komplekss tiek izvēlēts tā, lai reakcijā izveidotais produkts iekrāsotos. Tādējādi ar pozitīvu reakciju tiek novērota šķīduma krāsas maiņa. Lai noteiktu antigēnus, cietās fāzes nesēju sensibilizē ar antivielām, pēc tam secīgi ievada testa materiālu (antigēnus) un serumu pret antigēniem, kas marķēti ar fermentu. Reakcijas izpausmei tiek ievadīts enzīma substrāts. Ar pozitīvu reakciju notiek šķīduma krāsas maiņa.

13.6.3. Imunoblotēšana

Šīs metodes pamatā ir elektroforēzes un ELISA kombinācija. Veicot imūnblotēšanu (blotēšana no angļu valodas. traips- plankums) komplekss antigēnu maisījums vispirms tiek pakļauts poliakrilamīda gēla elektroforēzei. Iegūtais frakcionētais anti-

gēnu peptīdi tiek pārnesti uz nitrocelulozes membrānu. Pēc tam blotus apstrādā ar enzīmu iezīmētām antivielām pret konkrēto antigēnu, t.i. veic ELISA blotēšanu. Imunoblotēšanu izmanto tādu infekciju kā HIV diagnostikā.

13.6.4. Imūnā elektronu mikroskopija

Metode sastāv no mikroskopijas vīrusu (retāk citu mikrobu) elektronu mikroskopā, kas iepriekš apstrādāts ar atbilstošu imūnserumu, kas marķēts ar elektronoptiski blīviem preparātiem, piemēram, feritīnu, dzelzi saturošu proteīnu.

13.7. Plūsmas citometrija

Asins šūnas tiek diferencētas, pamatojoties uz lāzera citofluorometriju. Šim nolūkam vajadzīgās šūnas tiek iekrāsotas ar fluorescējošām monoklonālām antivielām pret CD antigēniem. Pēc apstrādes ar iezīmētām antivielām asins paraugs tiek izvadīts caur plānu cauruli un caur to tiek izvadīts lāzera stars, kas ierosina fluorohroma luminiscenci. Fluorescences intensitāte korelē ar antigēnu blīvumu uz šūnas virsmas, un to var kvantitatīvi noteikt, izmantojot fotopavairotāju. Iegūtie rezultāti tiek pārvērsti histogrammā.

Plūsmas citometrija tiek izmantota, lai noteiktu imūno stāvokli (limfocītu galveno populāciju saturs, intracelulāro un ārpusšūnu citokīnu saturs, NK šūnu funkcionālā aktivitāte, fagocitozes aktivitāte utt.).