infezione da HIV
L'infezione da HIV è una malattia causata dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV), che persiste a lungo nei linfociti, nei macrofagi, nelle cellule del tessuto nervoso, determinando un danno lentamente progressivo al sistema immunitario e nervoso del corpo, manifestato da infezioni, tumori, encefalite subacuta e altri cambiamenti patologici.
Gli agenti causali - virus dell'immunodeficienza umana dei tipi t e 2 - HIV-1, HIV-2 (HIV-I, HIV-2, virus dell'immunodeficienza umana, tipi I, 11) - appartengono alla famiglia dei retrovirus, la sottofamiglia di virus lenti... I virioni sono particelle sferiche di 100-140 nm di diametro. La particella virale ha un involucro fosfolipidico esterno contenente glicoproteine (proteine strutturali) con un certo peso molecolare, misurato in kilodalton. Nell'HIV-1, questi sono gp 160, gp 120, gp 41. L'involucro interno del virus che copre il nucleo è anche rappresentato da proteine con un peso molecolare noto - p 17, p 24, p 55 (l'HIV-2 contiene gp 140, mo 105, mo 36, pag 16, pag 25, pag 55).
Il genoma dell'HIV include l'RNA e un enzima della trascrittasi inversa (trascrittasi inversa). Affinché il genoma del retrovirus si connetta con il genoma della cellula ospite, il DNA viene prima sintetizzato sul modello di RNA virale utilizzando la trascrittasi inversa. Quindi il DNA del provirus viene inserito nel genoma della cellula ospite. L'HIV ha una marcata variabilità antigenica, significativamente superiore a quella del virus dell'influenza.
Nel corpo umano, l'obiettivo principale dell'HIV sono i linfociti T, che trasportano il maggior numero di recettori CD4 sulla superficie. Dopo che l'HIV è penetrato nella cellula con l'aiuto della revertasi, seguendo il modello del suo RNA, il virus sintetizza il DNA, che è integrato nell'apparato genetico della cellula ospite (linfociti T) e rimane lì per tutta la vita in uno stato di provirus. Oltre ai linfociti T-helper, sono interessati i macrofagi, i linfociti B. cellule di neuroglia, mucosa intestinale e alcune altre cellule. La ragione della diminuzione del numero di linfociti T (cellule CD4) non è solo l'effetto citopatico diretto del virus, ma anche la loro fusione con cellule non infette. Insieme alla sconfitta dei linfociti T nei pazienti con infezione da HIV, si nota l'attivazione policlonale dei linfociti B con un aumento della sintesi delle immunoglobuline di tutte le classi, in particolare IgG e IgA, e il successivo esaurimento di questa parte del sistema immunitario . La regolazione alterata dei processi immunitari si manifesta anche con un aumento del livello di alfa-interferone, beta-2-microglobulina a e una diminuzione del livello di interleuchina-2. Come risultato della disfunzione del sistema immunitario, specialmente quando il numero di linfociti T (CD4) scende a 400 o meno cellule in 1 μl di sangue, si creano le condizioni per la replicazione incontrollata dell'HIV con un aumento significativo del numero di virioni in vari ambienti del corpo. Come risultato della sconfitta di molte parti del sistema immunitario, una persona infetta da HIV diventa indifesa contro i patogeni di varie infezioni. Nella lobby dell'aumento dell'immunosoppressione, si sviluppano gravi malattie progressive che non si verificano in una persona con un sistema immunitario normalmente funzionante. Queste malattie sono definite dall'OMS come marker (indicatore) dell'AIDS.
Il primo gruppo - malattie che sono inerenti solo all'immunodeficienza grave (conta CD4 inferiore a 200). La diagnosi clinica viene effettuata in assenza di anticorpi anti-HIV o antigeni dell'HIV.
Il secondo gruppo - malattie che si sviluppano sia sullo sfondo di una grave immunodeficienza, sia in alcuni casi senza di essa. Pertanto, in tali casi, è necessaria la conferma di laboratorio della diagnosi.
Metodi sierologici per la diagnosi delle infezioni virali. Inibizione dell'emoagglutinazione. Inibizione dell'effetto citopatico per interferenza virale. Immunofluorescenza diretta. Microscopia immunoelettronica.
Con la maggioranza infezione virale sviluppare risposte immunitarie abituate a diagnostica... Le risposte cellulari vengono solitamente valutate nei test di citotossicità dei linfociti contro agenti infettivi o cellule bersaglio infettate da essi, o determinano la capacità dei linfociti di rispondere a vari Ag e mitogeni. Nel lavoro dei laboratori pratici, la gravità delle reazioni cellulari è raramente determinata. I metodi per identificare l'AT antivirale sono diventati più diffusi.
PH si basa su soppressione dell'effetto citopatogeno dopo aver mescolato il virus con AT specifico. Il virus sconosciuto viene miscelato con antisieri commerciali noti e, dopo opportuna incubazione, viene introdotto nel monostrato cellulare. L'assenza di morte cellulare indica una discrepanza tra l'agente infettivo e la nota AT.
Inibizione dell'emoagglutinazione
RTGA viene utilizzato per identificare i virus capace di agglutinare vari eritrociti. Per questo, il terreno di coltura contenente l'agente patogeno viene miscelato con un noto antisiero commerciale e introdotto nella coltura cellulare. Dopo l'incubazione, viene determinata la capacità della coltura di emoagglutinazione e, in sua assenza, viene fatta una conclusione sull'incoerenza del virus con l'antisiero.
Inibizione dell'effetto citopatico da interferenza virale
La reazione di inibizione dell'effetto citopatico dovuta all'interferenza dei virus utilizzato per identificare un agente patogeno che interferisce con un virus citopatogeno noto in una coltura di cellule sensibili. Per fare ciò, un siero commerciale viene introdotto nel terreno di coltura contenente il virus in studio (ad esempio, per il virus della rosolia, se si sospetta), incubato e infettato una seconda coltura; dopo 1-2 giorni, viene introdotto un virus citopatogeno noto (ad esempio, qualsiasi virus ECHO). In presenza di un effetto citopatogeno, si conclude che la prima coltura è stata infettata da un virus corrispondente all'AT applicato.
Immunofluorescenza diretta
Tra gli altri test, è stato trovato il più comune reazione di immunofluorescenza diretta(il più veloce, sensibile e riproducibile). Ad esempio, l'identificazione di CMV per effetto citopatogeno richiede almeno 2-3 settimane e quando si utilizza AT monoclonale etichettato, l'identificazione è possibile dopo 24 ore indagare utilizzando la microscopia a fluorescenza (consente di rilevare la presenza di fluorescenza delle cellule infette).
Immunomicroscopia elettronica
Immunomicroscopia elettronica(un analogo del metodo precedente) consente di identificare vari tipi di virus rilevati dalla microscopia elettronica (ad esempio vari tipi di virus dell'herpes), cosa che non può essere eseguita in base alle caratteristiche morfologiche. Al posto degli antisieri, per l'identificazione vengono utilizzati AT etichettati in modi diversi, ma la complessità e l'alto costo del metodo ne limitano l'applicazione.
119. Test sierologici utilizzati per diagnosticare le infezioni virali.
Rilevazione nel siero un paziente con anticorpi contro gli antigeni del patogeno consente di diagnosticare la malattia. Gli studi sierologici vengono anche utilizzati per identificare antigeni di microbi, varie sostanze biologicamente attive, gruppi sanguigni, antigeni tissutali e tumorali, complessi immunitari, recettori cellulari, ecc.
Quando un microbo è isolato dal paziente, l'agente patogeno viene identificato studiando le sue proprietà antigeniche utilizzando sieri immunodiagnostici, cioè sieri sanguigni di animali iperimmunizzati contenenti anticorpi specifici. Questo è il cosiddetto identificazione sierologica microrganismi.
In microbiologia e immunologia, sono ampiamente utilizzati reazioni di agglutinazione, precipitazione, neutralizzazione, reazioni che coinvolgono il complemento, utilizzando anticorpi e antigeni marcati (radioimmunologico, immunodosaggio enzimatico, metodi di immunofluorescenza). Le reazioni elencate differiscono nell'effetto registrato e nella tecnica di stadiazione, tuttavia, sono tutte basate sulla reazione di interazione di un antigene con un anticorpo e vengono utilizzate per rilevare sia gli anticorpi che gli antigeni. Le reazioni immunitarie sono caratterizzate da elevata sensibilità e specificità.
Caratteristiche dell'interazione di un anticorpo con un antigene sono alla base delle reazioni diagnostiche nei laboratori. Reazione in vitro tra antigene e anticorpo è costituito da una fase specifica e aspecifica. V fase specifica c'è un rapido legame specifico del sito attivo dell'anticorpo al determinante dell'antigene. poi arriva fase aspecifica - più lento, che si manifesta con fenomeni fisici visibili, ad esempio la formazione di fiocchi (fenomeno di agglutinazione) o precipitazioni sotto forma di torbidità. Questa fase richiede la presenza di determinate condizioni (elettroliti, pH ottimale dell'ambiente).
Il legame del determinante dell'antigene (epitopo) al centro attivo del frammento Fab degli anticorpi è dovuto alle forze di van der Waals, ai legami idrogeno e all'interazione idrofobica. La forza e la quantità di antigene legato dagli anticorpi dipendono dall'affinità, dall'avidità degli anticorpi e dalla loro valenza.
Alla domanda sulla diagnostica rapida:
1. La coltura isolata nella sua forma pura si presta alla diagnostica. 2. In laboratori appositamente attrezzati (è necessario ottenere l'autorizzazione) 3. Rispetto di regole rigorose quali: una stanza isolata, le necessarie tute protettive speciali, sanificazione completa obbligatoria della stanza dopo aver lavorato con l'agente patogeno, sanificazione dei ricercatori dopo la fine del opera. Metodi di diagnostica esperta. 1. Batteriologia - mezzi nutritivi politropici combinati per lo studio rapido di morph, tinctor, biochim. proprietà. Uso del nastro indicatore enzimatico, metodo elettrofisico, metodo dei dischi di carta impregnati di varie sostanze (glucosio, lattosio, ecc.) 2. Fagodiagnostica. 3. Sierodiagnostica - Metodo di Mancini, reazione di precipitazione in gel secondo Ascoli, RA, RPGA. 4. Batterioscopia - RIF diretta e indiretta. Metodi di diagnostica espressa per: Colera - M.Z. Ermolyeva, distretto di immobilizzazione con siero diagnostico del colera, RIF. Tularemia - RA su vetro, RPHA Plague - tipizzazione fagica, metodo dei dischi di carta di carboidrati, RPGA. Sib.yazva - Metodo Ascoli, RIF, RPGA. Modello di crescita: ci sono tre diffusi (anaerobi facoltativi), inferiori (anaerobi obbligati) e superficiali (aerobi obbligati).
Isolamento di una coltura pura di batteri anaerobi
Nella pratica di laboratorio, dovrai spesso lavorare con microrganismi anaerobici. Sono più stravaganti nei confronti dei mezzi nutritivi rispetto agli aerobi, hanno spesso bisogno di speciali integratori per la crescita, richiedono la cessazione dell'accesso all'ossigeno durante la loro coltivazione, la loro durata di crescita è più lunga. Pertanto, lavorare con loro è più complicato e richiede una notevole attenzione da parte di batteriologi e assistenti di laboratorio.
È importante proteggere il materiale che contiene agenti patogeni anaerobici dagli effetti tossici dell'ossigeno atmosferico. Pertanto, si consiglia di prelevare il materiale dai focolai di infezione purulenta durante la loro puntura con una siringa; il tempo tra il prelievo del materiale e la semina sul mezzo nutritivo dovrebbe essere il più breve possibile.
Poiché per la coltivazione di batteri anaerobici vengono utilizzati speciali mezzi nutritivi, che non devono contenere ossigeno e hanno un basso potenziale redox (-20 -150 mV), alla loro composizione vengono aggiunti indicatori come resazurina, blu di metilene e simili, che reagiscono ad un cambiamento di questo potenziale. Con la sua crescita, le forme incolori di indicatori si rinnovano e cambiano colore: la resazurina colora il rosa medio e il blu di metilene - blu. Tali cambiamenti indicano l'impossibilità di utilizzare i mezzi per la coltivazione di microbi anaerobici.
Aiuta a ridurre il potenziale redox dell'introduzione nel mezzo di non meno dello 0,05% di agar, che, aumentando la sua viscosità, aiuta a ridurre l'apporto di ossigeno. Questo, a sua volta, si ottiene anche utilizzando mezzi nutritivi freschi (non oltre due ore dopo la produzione) e ridotti.
Va notato che a causa delle peculiarità del metabolismo di tipo fermentativo dei batteri anaerobi, richiedono ambienti più ricchi di nutrienti e vitamine. Molto spesso usano infusi cardio-cerebrali ed epatici, estratti di soia e lievito, digerito idrolitico di caseina, peptone, triptone. È indispensabile aggiungere fattori di crescita come tween-80, emina, menadione, sangue intero o emolizzato.
L'isolamento di una coltura pura di microrganismi aerobi consiste in una serie di fasi. Il primo giorno (fase 1 dello studio), il materiale patologico viene portato in un contenitore sterile (provetta, pallone, bottiglia). Viene studiato in base al suo aspetto, consistenza, colore, odore e altri segni, viene preparato uno striscio, dipinto ed esaminato al microscopio. In alcuni casi (gonorrea acuta, peste), in questa fase è possibile effettuare una diagnosi precedente e, inoltre, scegliere il mezzo su cui verrà inoculato il materiale. Ha preso un ciclo batteriologico (il più delle volte usato), usando una spatola seguendo il metodo Drygalsky, con un tampone di garza di cotone. Le tazze vengono chiuse, capovolte, firmate con una matita speciale e poste in un termostato alla temperatura ottimale (37°C) per 18-48 anni. L'obiettivo di questa fase è ottenere colonie isolate di microrganismi. Tuttavia, a volte per accumulare il materiale, viene seminato su terreni nutritivi liquidi.
Gli strisci vengono preparati da colonie sospette, colorati con il metodo Gram per studiare le proprietà morfologiche e tintoriali dei patogeni e i batteri mobili vengono esaminati in una goccia "sospesa" o "schiacciata". Questi segni hanno un valore diagnostico estremamente grande nella caratterizzazione di alcuni tipi di microrganismi. I resti delle colonie indagate, accuratamente, senza toccarne altre, vengono rimossi dalla superficie del terreno e inoculati su un agar inclinato o su settori di una capsula di Petri con un terreno nutritivo per ottenere una coltura pura. Le provette oi piatti di coltura vengono posti in un termostato alla temperatura ottimale per 18-24 ore.
Sui terreni di coltura liquidi, i batteri possono anche crescere in modi diversi, sebbene le caratteristiche delle manifestazioni di crescita siano più povere rispetto a quelle densi.
I batteri possono causare un annebbiamento diffuso del mezzo, mentre il suo colore potrebbe non cambiare o acquisire il colore di un pigmento. Questo modello di crescita è più spesso osservato nella maggior parte dei microrganismi anaerobi facoltativi.
A volte si forma un sedimento sul fondo della provetta. Può essere friabile, omogeneo, viscoso, viscido, ecc. Il mezzo sopra di esso può rimanere trasparente o diventare torbido. Se i microbi non formano un pigmento, il precipitato ha un colore siruvato-bilio o giallastro. Di norma, i batteri anaerobici crescono in un rango simile.
La crescita parziale si manifesta con la formazione di scaglie, grani attaccati alle pareti interne della provetta. Allo stesso tempo, il mezzo rimane trasparente.
I batteri aerobici tendono a crescere superficialmente. Spesso si forma una pellicola delicata, incolore o bluastra sotto forma di un rivestimento appena percettibile sulla superficie, che scompare quando il mezzo viene scosso o agitato. Il film può essere umido, spesso, avere un fascio, una consistenza viscida e aderire al cappio, si estende dietro di esso. Tuttavia, esiste anche un film denso, secco e fragile, il cui colore dipende dal pigmento prodotto dai microrganismi.
Se necessario, viene eseguito uno striscio, colorato, esaminato al microscopio e i microrganismi vengono inoculati con un'ansa sulla superficie di un mezzo nutritivo denso per ottenere colonie isolate.
Il terzo giorno (fase 3 dello studio), viene studiata la natura della crescita di una coltura pura di microrganismi e viene eseguita la sua identificazione.
Innanzitutto, prestano attenzione alle peculiarità della crescita dei microrganismi sul terreno e fanno uno striscio, dipingendolo con il metodo Gram, per verificare la purezza della coltura. Se si osservano al microscopio batteri dello stesso tipo di morfologia, dimensione e proprietà tintoriali (capacità di dipingere), si conclude che la coltura è pura. In alcuni casi, già dietro l'aspetto e le caratteristiche della loro crescita, è possibile trarre una conclusione sul tipo di agenti patogeni isolati. La determinazione del tipo di batteri in base alle loro caratteristiche morfologiche è chiamata identificazione morfologica. La determinazione del tipo di agenti patogeni per le loro caratteristiche culturali è chiamata identificazione culturale.
Tuttavia, questi studi non sono sufficienti per trarre una conclusione definitiva sul tipo di microbi isolati. Pertanto, studiano le proprietà biochimiche dei batteri. Sono abbastanza diversi.
Molto spesso vengono studiate proprietà saccarolitiche, proteolitiche, peptolitiche, emolitiche, la formazione di enzimi di decarbossilasi, ossidasi, catalasi, plasmocoagulasi, DNasi, fibrinolisina, riduzione di nitrati a nitriti e simili. Per questo, esistono mezzi nutritivi speciali che vengono inoculati con microrganismi (fila variegata di Giss, MPB, siero di latte cagliato, latte, ecc.).
La determinazione del tipo di agente patogeno in base alle sue proprietà biochimiche è chiamata identificazione biochimica.
METODI DI COLTIVAZIONE E ISOLAMENTO DELLA COLTURA DI BATTERI PURI Per una coltivazione di successo, oltre a terreni correttamente selezionati e seminati correttamente, sono necessarie condizioni ottimali: temperatura, umidità, aerazione (alimentazione d'aria). La coltivazione degli anaerobi è più difficile degli aerobi; vengono utilizzati vari metodi per rimuovere l'aria dal mezzo nutritivo. L'isolamento di alcuni tipi di batteri (coltura pura) dal materiale di prova, che, di regola, contiene una miscela di vari microrganismi, è una delle fasi di qualsiasi studio batteriologico. Una coltura pura di microbi è ottenuta da una colonia microbica isolata. Quando una coltura pura viene isolata dal sangue (emocoltura), viene preliminarmente "coltivata" in un mezzo liquido: 10-15 ml di sangue sterile vengono inoculati in 100-150 ml di un mezzo liquido. Il rapporto tra sangue inoculato e terreno di coltura 1:10 non è casuale: è così che si ottiene la diluizione del sangue (il sangue non diluito ha un effetto dannoso sui microrganismi). Fasi di isolamento di una coltura pura di batteri Stadio I (materiale nativo) Microscopia (idea approssimativa della microflora). Semina su terreno nutritivo solido (ottenimento di colonie). Stadio II (colonie isolate) Studio delle colonie (proprietà culturali dei batteri). Esame microscopico di microbi in uno striscio colorato (proprietà morfologiche dei batteri). Inoculare su agar nutriente per isolare la coltura pura. Fase III (coltura pura) Determinazione delle proprietà culturali, morfologiche, biochimiche e di altro tipo per l'identificazione della coltura batterica IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI L'identificazione delle colture batteriche isolate viene effettuata studiando la morfologia dei batteri, le loro caratteristiche culturali, biochimiche e altre inerenti a ciascuna specie .
Basato sulla determinazione degli anticorpi antivirali nel sangue del paziente nelle reazioni sierologiche utilizzando antigeni virali specifici - diagnostici o sistemi di test speciali. Le reazioni sierologiche per le infezioni virali vengono eseguite in un mezzo liquido (RSK, RTGA, RNGA, RONGA, RTONGA, RIA), in un gel (RPG, RRG, RVIEF) o su un supporto in fase solida (ad esempio, sulle pareti di il pozzetto di una piastra di polistirene con fissazione di uno dei componenti della risposta immunitaria - antigene o anticorpo). Sono noti metodi in fase solida come ELISA, IEM, RGadsTO, RIF, RGads, RTGads.
Spesso, a causa della presenza di anticorpi antivirali naturali nel sangue della maggior parte delle persone sane, la diagnosi sierologica delle infezioni virali si basa sulla ricerca sieri abbinati, assunti all'inizio e nel mezzo della malattia o durante il periodo di convalescenza per determinare l'aumento del titolo anticorpale. Un aumento del titolo anticorpale di quattro volte o più è considerato significativo dal punto di vista diagnostico.
L'aumento della sensibilità dei metodi sierologici si ottiene mediante l'adsorbimento di antigeni o anticorpi sugli eritrociti (RNGA, RONGA, RTONGA, RGadsTO, RRG), marcatura con enzimi (ELISA), isotopi radioattivi (RIA, RPG) o fluorocromi (RIF), viene anche utilizzato il principio della lisi degli eritrociti ( sistemi) nell'interazione di antigeni e anticorpi in presenza di complemento (RSK, RRG).
Reazione di fissazione del complemento (CBC) come variante del legame del complemento al freddo (durante la notte a + 4 ° C) viene spesso utilizzato in virologia per la diagnosi retrospettiva di una serie di infezioni virali e per la determinazione di antigeni virus-specifici nei materiali dei pazienti.
Reazione di emolisi radiale (RHR) nel gel di agarosio si basa sul fenomeno dell'emolisi degli eritrociti sensibilizzati con un antigene, sotto l'influenza di anticorpi virus-specifici in presenza di complemento e viene utilizzato per la diagnosi sierologica di infezioni da influenza, ARVI, rosolia, parotite, togavirus.
Per formulare la reazione agli eritrociti di agnello (0,3 ml di sospensione al 10%) aggiungere 0,1 ml di antigene virale non diluito e la miscela viene mantenuta per 10 minuti a temperatura ambiente. 0,3 ml di eritrociti sensibilizzati e 0,1 ml di complemento vengono aggiunti all'1,2% di agarosio ad una temperatura di 42 ° C, la miscela viene versata su vetrini o nei pozzetti delle piastre di polistirene, vengono praticati dei fori nel gel di agarosio congelato utilizzando un punzone e riempito con i sieri indagati e di controllo. I bicchieri oi pannelli vengono coperti con un coperchio e posti in una camera umida per 16-18 ore in un termostato. La reazione è presa in considerazione dal diametro della zona di emolisi attorno ai fori riempiti di siero. Non c'è emolisi nel controllo.
Diagnostica di laboratorio
UDC -078
Diagnostica di laboratorio delle infezioni virali
N.N. Becco, V.M. Stakhanov
Istituto di Virologia intitolato a DI. Ivanovsky RAMS, Mosca
Diagnosi di laboratorio delle infezioni virali
N.N. Nosik, V.M. Stachanova
introduzione
L'espansione delle opportunità nel trattamento e nella prevenzione delle malattie virali utilizzando farmaci antivirali, immunomodulatori e vaccini con diversi meccanismi d'azione richiede una diagnostica di laboratorio rapida e accurata. La stretta specificità di alcuni farmaci antivirali richiede anche una diagnosi rapida e altamente specifica dell'agente infettivo. Sono necessari metodi quantitativi per la determinazione dei virus per il monitoraggio della terapia antivirale. Oltre a stabilire l'eziologia della malattia, la diagnostica di laboratorio è importante nell'organizzazione di misure antiepidemiche.
La diagnosi precoce dei primi casi di infezioni epidemiche consente l'attuazione tempestiva di misure antiepidemiche - quarantena, ospedalizzazione, vaccinazione, ecc. L'attuazione di programmi per l'eliminazione delle malattie infettive, come il vaiolo, ha dimostrato che man mano che vengono attuati, ruolo della diagnostica di laboratorio aumenta. La diagnostica di laboratorio nel servizio del sangue e nella pratica ostetrica svolge un ruolo essenziale, ad esempio l'identificazione dei donatori infetti virus dell'immunodeficienza umana(HIV), virus dell'epatite B (HBV), diagnosi di rosolia e infezione da citomegalovirus nelle donne in gravidanza.
Metodi diagnostici
Esistono tre approcci principali alla diagnosi di laboratorio delle infezioni virali (Tabella 1, Tabella 2):
1) esame diretto del materiale per la presenza di antigene virale o acidi nucleici;
2) isolamento e identificazione del virus da materiale clinico;
3) diagnostica sierologica basata sull'instaurazione di un significativo aumento degli anticorpi virali nel corso della malattia.
Con qualsiasi approccio scelto alla diagnostica virale, uno dei fattori più importanti è la qualità del materiale in studio. Quindi, ad esempio, per l'analisi diretta di un campione o per l'isolamento di un virus, il materiale di prova deve essere ottenuto all'inizio della malattia, quando l'agente patogeno è ancora espulso in quantità relativamente grandi e non è ancora legato agli anticorpi, e il volume del campione deve essere sufficiente per la ricerca diretta. È importante anche selezionare il materiale in accordo con la presunta malattia, cioè il materiale in cui, in base alla patogenesi dell'infezione, la probabilità della presenza del virus è maggiore.
Un ruolo importante nella diagnostica di successo è svolto dall'ambiente in cui viene prelevato il materiale, da come viene trasportato e da come viene immagazzinato. Quindi, strisci nasofaringei o rettali, il contenuto delle vescicole viene posto in un terreno contenente una proteina che impedisce la rapida perdita dell'infettività del virus (se si prevede di isolarlo), o in un tampone appropriato (se è progettato per lavorare con acidi nucleici).
Metodi diretti per la diagnosi del materiale clinico
I metodi diretti sono metodi che rilevano un virus, un antigene virale o un virus acido nucleico(NC) direttamente nel materiale clinico, ovvero sono i più veloci (2-24 ore). Tuttavia, a causa di una serie di peculiarità dei patogeni, i metodi diretti hanno i loro limiti (la possibilità di ottenere risultati falsi positivi e falsi negativi). Pertanto, spesso richiedono una conferma con metodi indiretti.
Microscopia elettronica (EM). Utilizzando questo metodo, è possibile rilevare il virus effettivo. Per una corretta determinazione del virus, la sua concentrazione nel campione dovrebbe essere di circa 1 · 10 6 particelle in 1 ml. Ma poiché la concentrazione dell'agente patogeno, di regola, nel materiale dei pazienti è insignificante, la ricerca del virus è difficile e richiede la sua precipitazione preliminare mediante centrifugazione ad alta velocità seguita da contrasto negativo. Inoltre, EM non consente la tipizzazione dei virus, poiché molti di essi non presentano differenze morfologiche all'interno della famiglia. Ad esempio, i virus dell'herpes simplex, della citomegalia o dell'herpes zoster sono morfologicamente virtualmente indistinguibili.
Una delle varianti EM utilizzate per scopi diagnostici è microscopia elettronica immunitaria(IEM), che utilizza anticorpi specifici contro i virus. Come risultato dell'interazione degli anticorpi con i virus, si formano complessi che, dopo il contrasto negativo, sono più facili da rilevare.
L'IEM è un po' più sensibile dell'EM e viene utilizzato quando il virus non può essere coltivato in vitro, ad esempio, durante la ricerca di agenti patogeni dell'epatite virale.
Reazione di immunofluorescenza (RIF). Il metodo si basa sull'uso di anticorpi legati a un colorante, ad esempio l'isotiocianato di fluoresceina. Il RIF è ampiamente utilizzato per rilevare gli antigeni virali nel materiale dei pazienti e per la diagnosi rapida.
In pratica vengono utilizzate due opzioni RIF: dritto e indiretto... Nel primo caso vengono applicati anticorpi marcati con colorante contro i virus, che vengono applicati alle cellule infette (striscio, coltura cellulare). Pertanto, la reazione procede in un unico passaggio. Lo svantaggio di questo metodo è la necessità di disporre di un ampio set di sieri coniugati specifici per molti virus.
Nella versione indiretta di RIF, al materiale in esame viene applicato un siero specifico, i cui anticorpi si legano all'antigene virale contenuto nel materiale, quindi un siero anti-specie viene stratificato alle gammaglobuline dell'animale in cui è stato preparato un siero immunitario specifico, ad esempio anti-coniglio, anti-cavallo, ecc. Il vantaggio della versione indiretta di RIF consiste nella necessità di un solo tipo di anticorpi marcati.
Il metodo RIF è ampiamente utilizzato per decifrare rapidamente l'eziologia delle infezioni virali respiratorie acute nell'analisi delle impronte di striscio dalla mucosa del tratto respiratorio superiore. L'uso riuscito di RIF per il rilevamento diretto del virus nel materiale clinico è possibile solo se contiene un numero sufficientemente elevato di cellule infette e una contaminazione insignificante con microrganismi che possono produrre luminescenza non specifica.
Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). I saggi di immunoassorbimento enzimatico per la determinazione degli antigeni virali sono, in linea di principio, simili al RIF, ma si basano sulla marcatura degli anticorpi con enzimi anziché con coloranti. Le più utilizzate sono la perossidasi di rafano e la fosfatasi alcalina; vengono utilizzate anche -galattosidasi e-lattamasi. Gli anticorpi marcati si legano all'antigene e tale complesso viene rilevato aggiungendo un substrato per l'enzima a cui sono coniugati gli anticorpi. Il prodotto finale della reazione può essere sotto forma di precipitato insolubile, quindi la registrazione viene effettuata utilizzando un microscopio ottico convenzionale, oppure sotto forma di prodotto solubile, che di solito è colorato (o può emettere fluorescenza o luminescenza) e è registrato strumentalmente.
Poiché ELISA può misurare antigeni solubili, non sono necessarie cellule intatte nel campione e quindi è possibile utilizzare diversi tipi di materiale clinico.
Un altro importante vantaggio del metodo ELISA è la capacità di quantificare gli antigeni, che consente di utilizzarlo per valutare il decorso clinico della malattia e l'efficacia della chemioterapia. ELISA, come RIF, può essere utilizzato sia direttamente che indirettamente.
L'ELISA in fase solida, che fornisce un prodotto di reazione colorato solubile, è il più ampiamente utilizzato. L'ELISA può essere utilizzato sia per determinare l'antigene (quindi gli anticorpi vengono applicati alla fase solida - il fondo del pozzetto di una piastra di polistirene), sia per determinare gli anticorpi (quindi gli antigeni vengono applicati alla fase solida).
Test radioimmunologico (RIA) ... Il metodo si basa sull'etichettatura di anticorpi con radioisotopi, che hanno fornito un'elevata sensibilità nella determinazione dell'antigene virale. Il metodo si è diffuso negli anni '80, soprattutto per la determinazione dei marcatori dell'HBV e di altri virus non coltivabili. Gli svantaggi di questo metodo includono la necessità di lavorare con sostanze radioattive e l'uso di apparecchiature costose (contatori gamma).
Metodi molecolari. Inizialmente, il metodo classico per rilevare il genoma virale era considerato un metodo altamente specifico di ibridazione di NK, ma oggigiorno, l'isolamento dei genomi virali utilizzando reazione a catena della polimerasi(PCR).
Ibridazione molecolare degli acidi nucleici. Il metodo si basa sull'ibridazione di filamenti complementari di DNA o RNA con formazione di strutture a doppio filamento e sulla loro identificazione mediante etichetta. A tale scopo vengono utilizzate speciali sonde a DNA o RNA, marcate con un isotopo (32 P) o biotina, che rilevano filamenti complementari di DNA o RNA. Esistono diverse varianti del metodo: - ibridazione puntiforme - si applicano NC isolate e denaturate ai filtri e poi si aggiunge una sonda marcata; indicazione dei risultati - autoradiografia quando si utilizza 32 P o colorazione - con avidina-biotina; - ibridazione blot - un metodo per isolare frammenti NK tagliati con endonucleasi di restrizione dal DNA totale e trasferiti su filtri di nitrocellulosa e testati con sonde marcate; utilizzato come test di conferma per l'infezione da HIV; - ibridazione sul posto- permette la determinazione di NK nelle cellule infette.
PCR basato sul principio della replicazione naturale del DNA. L'essenza del metodo risiede nella ripetizione ripetuta di cicli di sintesi (amplificazione) di una sequenza di DNA specifica del virus utilizzando una Taq DNA polimerasi termostabile e due primer specifici: i cosiddetti primer.
Ogni ciclo è composto da tre fasi con diverse condizioni di temperatura. In ogni ciclo, il numero di copie della sezione sintetizzata è raddoppiato. I frammenti di DNA appena sintetizzati fungono da modello per la sintesi di nuovi filamenti nel successivo ciclo di amplificazione, che consente a 25-35 cicli di generare un numero sufficiente di copie della regione di DNA selezionata per la sua determinazione, solitamente utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.
Il metodo è altamente specifico e molto sensibile. Consente di rilevare più copie di DNA virale nel materiale di prova. Negli ultimi anni, la PCR è stata sempre più utilizzata per la diagnosi e il monitoraggio delle infezioni virali (virus dell'epatite, dell'herpes, della citomegalia, del papilloma, ecc.).
È stata sviluppata una variante della PCR quantitativa, che consente di determinare il numero di copie del sito del DNA amplificato. La tecnica è complessa, costosa e non ancora sufficientemente standardizzata per l'uso di routine.
Metodi citologici attualmente hanno un valore diagnostico limitato, ma dovrebbero comunque essere utilizzati per un certo numero di infezioni. Vengono esaminati materiali di autopsia, biopsia, strisci, che, dopo un'adeguata elaborazione, vengono colorati e analizzati al microscopio. In caso di infezione da citomegalovirus, ad esempio, in sezioni di tessuto o nelle urine, si trovano caratteristiche cellule giganti - "occhio di gufo", in caso di rabbia - inclusioni nel citoplasma delle cellule (corpi di Babesh-Negri). In alcuni casi, ad esempio, nella diagnosi differenziale dell'epatite cronica, è importante valutare lo stato del tessuto epatico.
Possibili cariotipi della sindrome di Down
Malattie mitocondriali
I tratti caratteriali principali di una donna Leone
Posso andare al solarium?
Come spremere un brufolo a casa e dovresti farlo?