Metodo di prova diretto di Coombs. Test antiglobulina

- uno studio che aiuta a determinare il contenuto di anticorpi anti-eritrociti incompleti nel sangue. Questo test dell'antiglobulina può rilevare gli anticorpi contro nelle donne in gravidanza.

Inoltre, consente nelle fasi iniziali di diagnosticare l'anemia emolitica nei neonati con conflitto Rh. Questo aiuta a prevenire la distruzione dei globuli rossi, necessari per la normale formazione del sangue. Questo test è stato creato nel 1945 da Robert Coombs, motivo per cui ha preso il nome.

Il test di Coombs è uno studio versatile che consente una diagnosi tempestiva dei disturbi dell'ematopoiesi sia negli adulti che nei bambini.

Esistono i seguenti tipi di tali test:

1. Test di Coombs diretto- consente di determinare gli anticorpi situati sulla superficie degli eritrociti. Di solito, tale studio viene prescritto per sospetta emolisi, anemia emolitica autoimmune e altre malattie autoimmuni. Inoltre, viene effettuato dopo terapia farmacologica con farmaci a base di chinino, penicillina o metildopa o dopo una trasfusione di sangue. Per ottenere risultati più accurati, prima dello studio, è necessario interrompere completamente l'assunzione di farmaci almeno 1 settimana prima.
2. Test di Coombs indiretto - un test in grado di rilevare gli anticorpi anti-eritrociti nel plasma. Di solito viene eseguito durante la gravidanza e prima di una trasfusione di sangue. Gli anticorpi anti-eritrociti compaiono nel sangue di una persona durante il lavoro reattivo del sistema immunitario o come reazione a determinati farmaci. Per uno studio più accurato, vengono eseguite più recinzioni contemporaneamente con un intervallo di 2 ore.

Indicazioni per

Il test di Coombs viene eseguito solo se c'è un'indicazione seria. Questo è uno studio costoso e richiede tempo ed è un test specifico.

Di solito, le seguenti situazioni sono considerate indicazioni per la sua attuazione:

1. Con la trasfusione di sangue... Il test consente di determinare se il sangue del ricevente attecchirà nel corpo umano e se la donazione è possibile. In questo caso, è necessario esaminare il materiale sia del donatore che del ricevente. È importante determinare la natura degli anticorpi, perché nel caso della loro incompatibilità nel corpo sullo sfondo del conflitto Rh, il sistema immunitario viene distrutto. Ciò porta allo sviluppo di gravi malattie e, in rari casi, anche alla morte.
2. Prima dell'intervento chirurgico, quando c'è il rischio di perdita di sangue... Questo viene fatto in modo che il medico possa iniettare immediatamente sangue adatto per ripristinare il corpo.
3. Per identificare la sensibilizzazione Rh. Rhesus è un antigene specifico che si verifica nel corpo di ogni donna durante la gravidanza. Se la madre ha una Rh positiva e il padre è negativo, o viceversa, il bambino non ha dipendenza, può ereditare chiunque. Se il bambino riceve il rhesus opposto della madre, il rischio di sensibilizzazione è alto. Questo fenomeno è caratterizzato dalla miscelazione del sangue della madre e del bambino. Questo può accadere sia durante la gestazione che durante il parto.

Se si verifica un conflitto Rh nel corpo di una donna incinta, l'immunità della madre inizia a percepire il suo feto come un corpo estraneo. Per questo motivo, c'è un alto rischio che inizi ad attaccarlo.

Come risultato di tali azioni, il bambino può sviluppare gravi patologie. Molto spesso, si verifica l'eritroblastosi, un fenomeno in cui il corpo del bambino non può produrre un numero sufficiente di globuli rossi.

Inoltre, a causa del conflitto Rh, la morte fetale può verificarsi nell'utero o immediatamente dopo la nascita. Con il giusto approccio al trattamento, tali gravi conseguenze possono essere facilmente evitate.

Deviazioni dalla norma

Se il risultato è positivo per la reazione di Coombs, il medico conclude che ci sono anticorpi contro i globuli rossi nel siero del sangue. Ciò suggerisce che il sangue del donatore non può essere compatibile con il sangue del paziente.

Se un risultato positivo viene diagnosticato nel corpo di una donna incinta con sangue Rh-negativo, il suo corpo contiene anticorpi contro il sangue del feto.

Questo parla del conflitto Rh, che richiede un approccio estremamente attento alla gestione della gravidanza da parte del medico, nonché l'attuazione di tutte le istruzioni e raccomandazioni della donna.

Se gli anticorpi sono presenti nel sangue del bambino, viene diagnosticata una malattia emolitica del neonato. In questo caso, viene effettuato un secondo studio per determinare se un aumento del citrato di anticorpi si verifica o meno nel sangue della futura gestante.

Possibili complicazioni dal test di Coombs

Il test di Coombs è un test abbastanza sicuro che consente di diagnosticare una serie di malattie autoimmuni nelle fasi iniziali. Raramente causa complicazioni, di solito le conseguenze negative sono associate al prelievo di sangue.

Consistono in:

• Sanguinamento o emorragia sottocutanea
• Vertigini e svenimenti
• Contaminazione infettiva

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Il test dell'antiglobulina, progettato per rilevare anticorpi anti-eritrociti incompleti, è stato proposto da Coombs, Morant, Reis nel 1945 e successivamente ha ricevuto il nome di test di Coombs. L'essenza di questo metodo è che il siero antiglobulinico contenente anticorpi alle immunoglobuline umane, in seguito a reazione con eritrociti sensibilizzati con anticorpi incompleti, porta alla loro agglutinazione.

A seconda che gli anticorpi siano fissati sulla superficie degli eritrociti o siano liberi nel plasma sanguigno, viene utilizzato un test di Coombs diretto o indiretto.

Un test di Coombs diretto viene eseguito nei casi in cui vi sia motivo di ritenere che i globuli rossi in studio siano già presenti in vivo sono stati sensibilizzati con anticorpi appropriati, ad es. la prima fase della reazione - la fissazione degli anticorpi sulla superficie degli eritrociti - si è verificata nel corpo e la successiva aggiunta di siero antiglobulinico provoca l'agglutinazione delle cellule sensibilizzate.

Utilizzando un test di Coombs indiretto, vengono rilevati anticorpi incompleti presenti nel siero del test. In questo caso, la reazione procede in due fasi. La prima fase è l'incubazione degli eritrociti in esame con il siero in esame, durante la quale gli anticorpi contenuti nel campione di siero in esame vengono fissati sulla superficie degli eritrociti. La seconda fase è l'aggiunta del siero antiglobulinico.

Fino ad ora, il test di Coombs è ampiamente utilizzato nella pratica di laboratorio per la diagnosi di condizioni immunopatologiche, in particolare per le anemie emolitiche autoimmuni, caratterizzate dalla distruzione di eritrociti a causa del legame della membrana cellulare agli anticorpi e (o) componenti del complemento sistema. Con il suo aiuto, viene rivelata la presenza di Ig G (solitamente Ig G1 e Ig G3) sulla membrana degli eritrociti, che può attivare il complemento e talvolta il complemento (C3d). Tuttavia, nel periodo acuto della malattia a causa della distruzione degli eritrociti, su cui è stato fissato un gran numero di anticorpi, con una crisi emolitica, nonché con una quantità insufficiente di anticorpi nel decorso cronico della malattia, un negativo può essere osservato il test di Coombs diretto.

Va sottolineato che il test di Coombs indiretto rimane il metodo migliore per la selezione individuale dei mezzi trasfusionali, poiché consente la determinazione più accurata della compatibilità individuale del donatore e del ricevente in termini di antigeni eritrocitari.

Si raccomanda l'esecuzione aggiuntiva di un test antiglobulina diretto per la presenza di autoanticorpi quando si esaminano tutti i riceventi di organi e tessuti nel periodo pre-trapianto e i riceventi di cellule staminali ematopoietiche anche dopo il trapianto.

Oltre all'immunoematologia e alla transfusiologia, i test antiglobulinici sono ampiamente utilizzati nella diagnosi di una serie di condizioni patologiche: nelle malattie ematologiche, comprese le malattie linfoproliferative, nelle malattie sistemiche del tessuto connettivo, nella malattia di Sjogren, nell'epatite cronica attiva, ecc.

I test di Coombs sono utilizzati attivamente nella genetica medica e nella medicina legale per determinare gli antigeni eritrocitari di superficie.

Il test di Coombs si riferisce a un metodo di ricerca piuttosto laborioso che richiede un'attenzione particolare nella sua implementazione. Quando lo si utilizza, ci sono alcune difficoltà associate, in particolare, all'interpretazione di reazioni debolmente positive. È noto che reazioni false debolmente positive o negative durante l'esecuzione dei test di Coombs possono essere il risultato di un lavaggio insufficientemente efficace degli eritrociti, della neutralizzazione del reagente antiglobulina con tracce di siero e del contatto con una superficie non grassa su cui l'antiglobulina può essere riparato, perdendo così la sua attività. Un altro inconveniente del test di Coombs è l'instabilità del reagente antiglobulina, la cui produzione e conservazione hanno determinate caratteristiche, che rende difficile anche quantificare la reazione di emoagglutinazione con siero antiglobulina.

Inoltre, studi condotti da A. Holburn, D. Voak et al. hanno dimostrato che la causa dei risultati falsi negativi può essere un eccessivo agitazione durante la risospensione della sospensione eritrocitaria. Risultati errati durante l'esecuzione di test antiglobulinici possono anche essere causati dalla presenza di una miscela di anticorpi anti-complementari nel reagente antiglobulina, in particolare ai componenti del complemento C3d, C3c, C4c e C4d, che vengono adsorbiti sulla superficie degli eritrociti del test durante l'incubazione e creare l'aspetto di un risultato positivo.

Questi svantaggi possono essere facilmente eliminati lavando accuratamente i campioni di prova e controllando le condizioni di reazione.

Nell'ultimo decennio, è stata utilizzata una soluzione isotonica a bassa forza ionica (LISS) per abbreviare il tempo del test di Coombs indiretto e aumentarne la sensibilità.

Il vantaggio indiscutibile dei test antiglobulinici, secondo numerosi autori, è la loro elevata sensibilità, che supera significativamente la risoluzione dei metodi di ricerca alternativi utilizzati per rilevare gli anticorpi non agglutinanti.

Abbiamo confrontato la risoluzione dei metodi di analisi del siero del sangue per la presenza di anticorpi incompleti utilizzando siero di poliglucina, gelatina e antiglobulina. Nel corso dello studio, i titoli degli anticorpi anti-D incompleti sono stati monitorati in 140 campioni di siero di sangue da donatori isoimmuni utilizzando test di gelatina, poliglucina e antiglobulina indiretta. La formulazione di questi metodi è stata eseguita secondo metodi generalmente accettati.

È stato riscontrato che in termini di risoluzione, i metodi per rilevare la sensibilizzazione degli eritrociti con anticorpi anti-D sono disposti come segue: il più sensibile è il test di Coombs indiretto, quindi il test della gelatina e il meno informativo è il test della poliglucina. I risultati ottenuti in questa serie di esperimenti sono pienamente coerenti con i dati della letteratura, il che ci consente di concludere che la sensibilità dei test di Coombs è piuttosto elevata, il che consente di identificare con un alto grado di affidabilità la presenza di antieritrociti anticorpi nel corpo che non causano l'agglutinazione dei globuli rossi.

Tuttavia, quando si impostano i test di Coombs nella pratica, ci sono casi in cui non vengono rilevati anticorpi incompleti, sebbene il quadro clinico della malattia o la precedente immunizzazione ne indichino la possibile presenza. In questi casi, si può presumere che la quantità di anticorpi non sia sufficiente per farli precipitare dagli anticorpi sierici antiglobulinici.

Questa conclusione è stata confermata dal nostro stesso esperimento, in cui, utilizzando il metodo della microelettroforesi analitica delle cellule, è stata stabilita la presenza di anticorpi anti-D sugli eritrociti del test, che non sono stati rilevati nel test di Coombs indiretto. In questa serie di esperimenti, il siero antiglobulina è stato aggiunto agli eritrociti precedentemente incubati con sieri ottenuti dal sangue di donatori immunizzati durante il periodo di antitelogenesi in uso, ad es. durante il periodo in cui gli anticorpi non sono stati rilevati in essi con metodi noti, compreso il test di Coombs.

Negli studi effettuati, l'evidenza della presenza di anticorpi incompleti sulla superficie degli eritrociti è stata una variazione statisticamente significativa nella mobilità elettroforetica dei globuli rossi sensibilizzati dopo l'aggiunta di siero antiglobulina. Va notato che successivamente, gli anticorpi anti-D sono stati determinati nel siero del sangue di tutti i donatori immunizzati nel test di Coombs indiretto.

Gillerand et al. hanno inoltre dimostrato che i test antiglobulinici sono caratterizzati da una certa soglia di sensibilità: un risultato positivo si nota solo quando almeno 500 molecole di Ig G sono fissate sulla superficie di un eritrocita.

Inoltre, la letteratura fornisce la prova che un possibile risultato negativo del test di Coombs può essere associato a una bassa affinità di anticorpi che sensibilizzano gli eritrociti, per cui sono facilmente eluiti dalla superficie dei globuli rossi durante il processo di lavaggio.

Tenendo conto di quanto sopra, possiamo concludere che in alcuni casi un risultato negativo del test di Coombs non è ancora prova dell'assenza di anticorpi fissati sulla superficie degli eritrociti.

È noto che le reazioni di Coombs sono altamente specifiche e possono rilevare la maggior parte dei tipi di anticorpi incompleti. Tuttavia, come dimostrato da alcuni dati sperimentali, i test antiglobulinici possono essere positivi in \u200b\u200bcondizioni non immunologiche. E. Muirhead et al. Il secondo giorno dopo la somministrazione della fenilidrazina, è stato osservato che i cani avevano un test di Coombs positivo. Una così rapida comparsa di una reazione positiva è una prova contro la sua natura immunologica e, piuttosto, è associata ad adsorbimento aspecifico della proteina sulla superficie degli eritrociti.

M. Williams et al. hanno scoperto che l'acido clavulanico può anche causare una reazione positiva, che, secondo gli autori, è associata ad adsorbimento aspecifico di proteine \u200b\u200bplasmatiche sulla superficie degli eritrociti. Un effetto simile è stato osservato con gli antibiotici cefalosporinici.

Gli autori degli studi di cui sopra sottolineano la natura non immunologica dei risultati positivi ottenuti dai test di Coombs e insistono sul fatto che queste sostanze sono in grado di causare una modifica delle membrane dei globuli rossi, a seguito della quale gli eritrociti possono adsorbire le proteine \u200b\u200b( in particolare, albumina), che sono normalmente presenti nel plasma sanguigno e non possiedono proprietà di anticorpi. Inoltre, è possibile che sia lo xenobiotico, adsorbito sulla superficie cellulare, a fungere da collegamento tra la membrana cellulare e le proteine \u200b\u200bplasmatiche.

Per la corretta interpretazione dei risultati dell'impostazione dei test antiglobulinici, deve essere preso in considerazione anche il rapporto quantitativo tra eritrociti giovani e maturi nel sangue periferico. È stato riscontrato che i reticolociti escreti dal corpo durante il periodo di maggiore rigenerazione dell'eritrone possono essere agglutinati dal siero antiglobulinico.

Un test antiglobulina diretto positivo, el. È anche osservato in varie condizioni patologiche, accompagnate da disturbi del sistema immunitario, processi infiammatori che portano all'adsorbimento aspecifico di anticorpi di diversa specificità sulle membrane degli eritrociti. Ciò suggerisce che le molecole Ig G non interagiscono con antigeni specifici degli eritrociti, ma si fissano solo sulla superficie delle cellule in esame.

Va tenuto presente che quando si imposta un test di Coombs in caso di malattie caratterizzate dallo sviluppo di disproteinemia o dalla comparsa di paraproteine, un risultato positivo è dovuto alla presenza sulla superficie di eritrociti di proteine \u200b\u200bche non hanno le proprietà di anticorpi, che indica anche l'insufficiente specificità dei campioni di antiglobulina rispetto alla natura della proteina rilevata con il loro aiuto.

Pertanto, come hanno dimostrato numerosi studi, i risultati positivi dei test antiglobulinici diretti e indiretti non sono una prova assoluta della presenza di anticorpi, poiché si possono osservare reazioni positive in varie condizioni patologiche che non sono associate a isosensibilizzazione o autosensibilizzazione del corpo. Pertanto, solo un confronto dei risultati di diversi metodi immunoserologici con il quadro clinico della malattia consente di giudicare completamente il processo patologico in via di sviluppo.

Un test antiglobulina indiretto positivo con un campione diretto negativo indica solitamente la presenza di alloanticorpi liberi nel siero studiato, associati a precedenti trasfusioni di sangue o gravidanze.

Il test di Coombs è spesso positivo con esacerbazione dell'emoglobinuria parossistica notturna; un test di Coombs positivo con anti-C3 e anti-C3dg è un marker di malattia da agglutinine fredde.

Nei casi in cui il rischio di sviluppare una malattia emolitica dei neonati è elevato, i risultati dei test antiglobulinici diretti e indiretti sono di grande importanza per la diagnosi (il più delle volte durante la gravidanza) e, se necessario, il monitoraggio dinamico dell'aspetto e del cambiamento nell'anticorpo titolo. Molto spesso, la malattia emolitica dei neonati è associata all'incompatibilità della madre e del feto per l'antigene D, meno spesso per gli antigeni del sistema AB0 e ancora meno spesso per altri antigeni (C, C, K, ecc.). L'antithe risultante la, essendo, di regola, gli anticorpi incompleti della classe Ig G, sono chiaramente rilevati nel test dell'antiglobulina indiretta. In questa malattia, il titolo corretto e la specificità degli anticorpi identificati sono di grande importanza, poiché esiste una certa correlazione tra il livello di anticorpi anti-eritrociti nel sangue di una donna incinta e la possibile prognosi della gravità della malattia emolitica.

Il test di Coombs indiretto è richiesto anche nella pratica clinica per garantire una terapia trasfusionale sicura. La sua implementazione è una componente obbligatoria degli studi immunoematologici sui donatori e di varie categorie di riceventi, così come gli esami di routine di tutti i pazienti delle istituzioni mediche che possono richiedere la trasfusione di sangue e dei suoi componenti.

Un test antiglobulina indiretto viene utilizzato nei seguenti casi:

Per una determinazione più accurata dell'affiliazione Rh (antigene D) con risultati indistinti della determinazione del fattore Rh con altri metodi (poliglucina, gelatina, ecc.);

Per rilevare antigeni eritrocitari deboli (sistemi Kell, Duffy, Kidd, Lewis, ecc.) E anticorpi contro questi antigeni;

Per il rilevamento e l'identificazione di anticorpi anti-eritrociti alloimmuni, inclusi gli anticorpi che causano reazioni emolitiche post-trasfusionali;

Determinare la presenza di anticorpi immunitari del sistema AB0 nelle complicanze emolitiche trasfusionali;

Come test di compatibilità nella selezione individuale del sangue trasfuso e dei suoi componenti.

Pertanto, il test di Coombs è un importante test diagnostico utilizzato in vari campi della medicina (ematologia, ostetricia, reumatologia, transfusiologia, diagnostica clinica e di laboratorio, ecc.). La conoscenza delle specifiche del test di Coombs contribuirà ad aumentare l'affidabilità dei risultati ottenuti e contribuirà alla corretta interpretazione dei dati di laboratorio.

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Test dell'antiglobulina o reazione di Coombs Viene eseguito per rilevare alcuni anticorpi che attaccano i globuli rossi (eritrociti).

Gli anticorpi sono proteine \u200b\u200bprodotte dal sistema immunitario. In genere, gli anticorpi si legano a sostanze estranee come batteri e virus e le distruggono.

2. Perché hai bisogno di un test degli anticorpi?

È possibile eseguire un test degli anticorpi nei seguenti casi:

Prima della trasfusione di sangue

Probabilmente sai che una persona può avere uno dei quattro gruppi sanguigni. E può essere eseguito un test antiglobulinico per determinare se è possibile una trasfusione di sangue. Se stai ricevendo una trasfusione, il sangue del donatore deve corrispondere al tuo tipo (avere gli stessi antigeni). Se gli antigeni differiscono durante la trasfusione, il sistema immunitario distruggerà le cellule trasfuse. Questo può portare a gravi malattie e persino alla morte. Questo è il motivo per cui trovare il giusto gruppo sanguigno è un fattore così importante.

Per identificare il rischio di sensibilizzazione Rh

Rhesus è un antigene. Il suo nome completo è fattore Rh. Il test di Coombs viene utilizzato per rilevare gli anticorpi Rh nel sangue delle donne in gravidanza. Se una donna con sangue Rh negativo è incinta di un figlio Rh positivo (può essere trasmesso dal padre), c'è il rischio di sensibilizzazione Rh. La sensibilizzazione Rh si verifica quando il sangue di un bambino si mescola con il sangue della madre durante la gravidanza o il parto. Se il gruppo sanguigno della madre è incompatibile con il gruppo sanguigno del bambino, il suo sistema immunitario può attaccare il feto, percependolo come un oggetto estraneo. In questo caso, può svilupparsi una grave malattia chiamata eritroblastosi fetale. In rari casi, se la malattia non viene curata, il feto o il neonato possono morire.

A una donna Rh negativa può essere somministrata un'iniezione di gammaglobulina anti-Rh (p. Es., RhoGAM), che viene utilizzata per prevenire lo sviluppo della malattia emolitica Rh.

Per la diagnosi dell'anemia emolitica autoimmune

L'anemia emolitica autoimmune è una malattia rara associata alla formazione di anticorpi contro gli auto-antigeni eritrocitari.

3. Tipi di test dell'antiglobulina

Esistono due tipi di test dell'antiglobulina o reazione di Coombs: diretta e indiretta.

Test di Coombs diretto o test diretto dell'antiglobulina rileva gli anticorpi associati ai globuli rossi. È usato per identificare l'anemia. In questa malattia, i globuli rossi vengono distrutti più velocemente di quanto vengono prodotti.

Test di Coombs indiretto o test dell'antiglobulina indiretto viene eseguita per la ricerca di anticorpi non associati ai globuli rossi. Per il campione viene utilizzato il siero di sangue, che contiene anticorpi. Questa procedura è piuttosto rara: viene eseguita principalmente per determinare la possibilità di una trasfusione di sangue o come fase dell'esame delle donne in gravidanza.

4. Risultati della reazione di Coombs

Norma:

Risultato del test negativo: nessun anticorpo rilevato.

• Test di Coombs diretto... Un test dell'antiglobulina diretto negativo significa che il tuo sangue non ha anticorpi legati ai globuli rossi.
• Test di Coombs indiretto... Un test antiglobulina indiretto negativo significa che il tuo sangue è compatibile con il sangue del donatore. Per una donna incinta, un tale risultato significa che il suo corpo non ha sviluppato anticorpi contro il gruppo sanguigno Rh-positivo di suo figlio (la sensibilizzazione Rh non si è verificata).

Deviazione dalla norma:

• Test di Coombs diretto... Un test dell'antiglobulina diretto positivo significa che il tuo sangue ha anticorpi che combattono i globuli rossi. Può essere causato da una trasfusione di sangue incompatibile o da condizioni mediche come l'anemia emolitica o la malattia emolitica del neonato (HDN).
• Test di Coombs indiretto... Un risultato positivo del test dell'antiglobulina indiretta significa che il tuo sangue è incompatibile con il sangue del donatore. In una donna incinta, questi risultati indicano la presenza di anticorpi contro il fattore Rh positivo nel sangue del bambino (sensibilizzazione Rh). Se il bambino è Rh positivo, la madre sarà attentamente monitorata da un medico per tutta la gravidanza.

Principio antiglobulinico... Gli anticorpi anti-eritrociti di tipo incompleto e le molecole del complemento (C) situate sulla superficie degli eritrociti sono rilevabili - test diretto - dalla loro agglutinazione a contatto con siero animale contenente anticorpi contro l'antiglobulina umana (siero antiglobulina). Gli anticorpi incompleti del siero libero vengono rilevati - un test indiretto - fissandoli su una miscela di eritrociti normali del gruppo 0, tutti antigeni dei quali appartengono al sistema Rh noto, quindi agglutinati sotto l'influenza del siero antiglobulinico.

Materiali, reagenti del test dell'antiglobulina di Coombs: Tubi da 10/100 ml; Pipette graduate da 1, 2 ml; pipette pastorizzate; treppiedi; diapositive non lucidate; Soluzione di NaCl 8,5 ‰; eritrociti. Gli eritrociti del paziente, così come quelli appartenenti al gruppo 0, saranno ottenuti da sangue appena raccolto su una sostanza anticoagulante (soluzione EDTA).

Gli eritrociti del gruppo 0 dovrebbero essere selezionati in modo che provengano da persone normali e contengano tutti antigeni Rh... Possono essere conservati fino a 7 giorni in plasma autologo a una temperatura di + 4 ° C. In assenza di globuli rossi del gruppo 0, un noto mosaico antigenico, può essere utilizzata una miscela di globuli rossi del gruppo 0, globuli rossi Rh positivi e Rh negativi.

Siero il paziente deve essere campionato di recente.

Siero antiglobulinico prodotto dall'Istituto. Dr. I. Cantacuzino, disponibile in forma liofilizzata in fiale da 1 ml. Dopo la dissoluzione, conservare il siero a -20 ° C.

Tecnica di test dell'antiglobulina di Coombs:
e) Test di Coombs diretto: Sciacquare gli eritrociti del paziente 3 volte con una soluzione di NaCl 8,5 ‰.
Applicare una grande goccia dalle diluizioni di siero antiglobulina a diversi vetrini da microscopio e accanto ad essa - una piccola goccia dal sedimento eritrocitario del paziente; mescolare le gocce dall'angolo del bicchiere. Lasciare il materiale preparato sul tavolo per 5 minuti, quindi esaminare la presenza di agglutinati. In caso di risultato positivo, determinare il titolo agglutinante massimo.

b) Test di Coombs indiretto: eritrociti del gruppo 0, Rhesus-positivi e Rhesus-negativi, sciacquare 3 volte con una soluzione di NaCl 8,5 to ed esporre al siero del paziente alla velocità di 2 gocce di eritrociti per 8-10 gocce di siero, quindi, per 60 minuti, incubare a 37 ° DA. Successivamente, lavare nuovamente gli eritrociti tre volte e agire su di essi con siero antiglobulina, secondo le istruzioni per il test di Coombs diretto.

Quando si tratta di sugli anticorpi attivi freddi effettuare sensibilizzazione di erythrocytes del gruppo 0 durante 60 minuti. ad una temperatura di + 4 ° C.

Nota: 1) Non eseguire un test di Coombs diretto su eritrociti conservati per uno o più giorni a una temperatura di + 4 ° C o temperatura ambiente, poiché i risultati potrebbero rivelarsi falsi positivi a causa della fissazione di anticorpi attivi a freddo incompleti presente nel siero normale. 2) In caso di iperproteinemia grave, lavare gli eritrociti 4-5 volte e verificare l'assenza di proteine \u200b\u200bdel siero di latte nell'ultimo liquido di lavaggio utilizzando acido solfosalicilico.

Possibili 2 μg di IgG / ml residui nel barattolo di sedimento eritrocitario neutralizza il siero antiglobulinico... Il test di Coombs può essere eseguito anche utilizzando sieri monospecifici anti-IgG, -IgM, -IgA -C3 e -C4 al fine di chiarire il tipo di profondità sulla superficie degli eritrociti, ad esempio, in chi soffre di anemia emolitica autoimmune.

La reazione di Coombs è un metodo efficace per rilevare gli antigeni eritrocitari e gli anticorpi anti-eritrociti nel sangue umano in una reazione di agglutinazione indiretta. La base del test è l'uso di reagenti monoclonali specifici a base di immunoglobuline di classe G (IgG) nella tipizzazione degli antigeni eritrocitari, seguito dall'uso del siero antiglobulina di Coombs (AGS) nella seconda fase della reazione.

L'AGS è prodotto miscelando il siero del sangue di animali da laboratorio immunizzati con immunoglobuline umane di classe G e anticorpi monoclonali a uno dei componenti, il complemento C3D del siero umano. L'AGS causa l'agglutinazione degli eritrociti sensibilizzati con anticorpi specifici. In assenza di anticorpi sugli eritrociti sotto l'influenza di AGS, non si verifica una reazione positiva.

La reazione indiretta di Coombs consente di determinare la presenza di:

• antigeni eritrocitari rilevati dai reagenti IgG (anticorpi "incompleti", ad esempio, reagenti monoclonali anti-D, anti-F Y a, anti-F Y b);
• anticorpi anti-eritrociti della classe IgG.

Test antiglobulinico indiretto: rilevamento degli antigeni eritrocitari

Presentiamo il metodo della reazione indiretta di Coombs utilizzando l'esempio dello tsoliclone IgG anti-D.

1. Etichettare una provetta pulita: indicare il nome della persona in esame.
2. Pipettare 2 gocce (circa 0,1 ml) di zoliclon IgG anti-D nella provetta.
3. Aggiungere 2 gocce di sospensione al 5% degli eritrociti analizzati, precedentemente lavati con soluzione fisiologica. Mescolare i campioni di prova con lo zoliclon.
4. Incubare la miscela a bagnomaria o incubatore a 37 ° C per 30 minuti.
5. Aggiungere 5-10 ml di soluzione salina alla provetta con una pipetta Pasteur.
6. Centrifugare la provetta a 1200 g di accelerazione centrifuga a 18 - 25 ° C per un minuto.
7. Rimuovere la soluzione salina.
8. Ripetere la procedura per il lavaggio degli eritrociti mediante centrifugazione altre 2 - 3 volte.
9. Aggiungere 2 gocce di siero antiglobulina al pellet di cellule del sangue, mescolare.
10. Centrifugare la provetta a 1200 g di accelerazione centrifuga per un minuto a una temperatura di 18-25 ° C.
11. Aggiungere da 3 a 5 gocce di soluzione fisiologica utilizzando una pipetta o una pipetta Pasteur.
12. Risospendere il pellet e valutare visivamente l'agglutinazione. Gli agglutinati espressi sul fondo della provetta sullo sfondo di una soluzione limpida indicano la rilevazione dell'antigene eritrocitario. Una sospensione opaca di cellule del sangue indica l'assenza di antigene.

Reazione di Coombs: screening per gli anticorpi anti-eritrociti isoimmuni

Lo studio viene condotto nell'ambito di un test di compatibilità individuale per tutti gli antigeni degli eritrociti nel sangue del donatore e del ricevente. La conclusione sulla piena compatibilità del siero del ricevente con gli eritrociti del donatore viene fatta sulla base dell'assenza di emolisi e / o agglutinazione in tutte le fasi dell'analisi. Segni di emolisi e / o agglutinazione in qualsiasi fase del test indicano un'incompatibilità dei campioni di sangue.

Valutazione di compatibilità secondo il sistema AB0, rilevazione di anticorpi "freddi"

1. Preparare un campione di sangue da un donatore:
   • aggiungere 0,2 ml di sangue alla provetta con un dosatore automatico;
   • Lavare gli eritrociti 3 volte in 5,0 ml di soluzione fisiologica;
   • risospendere il pellet in 3-4 ml di soluzione LISS a bassa forza ionica.
2. Etichetta la seconda provetta pulita con il nome del ricevente e il nome del donatore.
3. Pipettare 0,1 ml di siero ricevente in una provetta etichettata con una pipetta automatica.
4. Aggiungere 2 gocce di sospensione di eritrociti al 5% nella soluzione LISS.
5. Centrifugare immediatamente la miscela a 1200 g di accelerazione centrifuga a 18 - 25 ° C per 15 - 20 secondi.
6. Separare il sedimento dal fondo agitando delicatamente il tubo. Valuta la presenza di agglutinati. La presenza di emolisi e / o agglutinati significa:
   • incompatibilità nel sistema AB0;
   • la presenza nel siero del paziente di anticorpi "freddi" della classe IgM o IgA, non specifici per gli antigeni AB0.

Rilevazione di anticorpi "caldi"

1. In assenza di emolisi e / o agglutinati, incubare la provetta per 10-15 minuti a 37 ° C.
2. Centrifugare la provetta a 1200 g per 15-20 secondi a temperatura ambiente.
3. Agitare la provetta e verificare la presenza di emolisi e / o agglutinati nel surnatante. Un risultato positivo indica la rilevazione di anticorpi IgM "caldi" contro gli antigeni eritrocitari del donatore nel siero del paziente.

Rilevazione degli anticorpi IgG nel test di Coombs

1. Se il risultato è negativo nell'ultima fase dello studio, aggiungere 5 ml di soluzione di NaCl allo 0,9% alla provetta con una pipetta Pasteur.
2. Centrifugare la provetta a 1200 g per 15-20 secondi a una temperatura dell'aria di 18-25 ° C. Smaltire il surnatante con cura con una pipetta Pasteur.
3. Ripeti il \u200b\u200blavaggio da erythrocytes 2 - altre 3 volte.
4. Aggiungere da 1 a 2 gocce di siero antiglobulina nella provetta. Mescola bene.
5. Centrifugare la provetta a 1200 g per 15-20 secondi.
6. Rompere delicatamente il sedimento eritrocitario e valutare visivamente il risultato della reazione. Il rilevamento dell'agglutinazione significa la presenza di anticorpi IgG contro gli antigeni eritrocitari del donatore nel siero del paziente.